QuEChERS法與UPLC—MS/MS法測(cè)定水稻糙米中的吡唑醚菌酯殘留

沈菁　王小飛　陳舒　陳思　彭西甜

摘要：采用QuEChERS的前處理方法，建立了一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的水稻糙米中吡唑醚菌酯殘留量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）分析方法。該方法以乙腈作為萃取溶劑，經(jīng)液液分配萃取后，鹽析分層，N-丙基-乙二胺鍵合硅膠（PSA）和C18鍵合硅膠凈化后，進(jìn)行超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）分析，實(shí)現(xiàn)了樣品的快速提取、凈化、分離和檢測(cè)。在優(yōu)化條件下，吡唑醚菌酯在0.01～0.5 mg/L的范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系（R2=0.990 0），回收率為82%～106%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于11%，該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。經(jīng)水稻田間試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)糙米中的吡唑醚菌酯殘留量在0.006～0.023 mg/kg之間。

關(guān)鍵詞：吡唑醚菌酯；QuEChERS；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）；糙米；最終殘留

中圖分類號(hào)：O658 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）24-6366-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.070

Abstract：In this paper，a high efficient，rapid and sensitive determination method of pyraclostrobine in brown rice samples was proposed by a modified QuEChERS （quick，easy，cheap，effective，rugged and safe） method. Acetonitrile （ACN） was used to extract the residue of pyraclostrobine in samples.After salting out，the organic layer was cleaned up using PSA and C18 sorbents，and then the solution was directly analyzed by ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS），resulting in rapid extraction，clean-up，separation and detection of pyraclostrobine in samples. Under the optimized LC and MS conditions，good linearity in the range of 0.01～0.05 mg/kg was obtained for pyraclostrobine with R2 of 0.990 0.The method recoveries of the pyraclostrobine spiked at low，middle and high concentrations in blank rice samples were from 82% to 106%，with relative standard deviations less than 11%，indicating that the proposed method has good accuracy and precision.At last，the proposed method was applied to analyze the final residues of pyraclostrobine in samples，and the residues of pyraclostrobine in brown rice samples were in the range of 0.006～0.023 mg/kg.

Key words：pyraclostrobine；QuEChERS；utra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry； brown rice；final residues

吡唑醚菌酯又名唑菌胺酯、百克敏，是一種含有吡唑結(jié)構(gòu)的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑[1]，可以防治由多種真菌病原引起的病害，例如谷類作物的白粉病、銹病、葉枯病等[2，3]。目前，吡唑醚菌酯在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛，其在作物中的殘留不可避免，因此開(kāi)展作物中吡唑醚菌酯殘留的檢測(cè)方法研究很有必要。吳潔珊等[4]采用氣相色譜測(cè)定柑橘中多種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的殘留量；薄海波等[5]采用氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定食品中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留；徐英江等[6]采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定蔬菜中殘留的吡唑醚菌酯。傳統(tǒng)的紫外或熒光檢測(cè)器在低殘留水平下抗干擾能力差，常常出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，而質(zhì)譜檢測(cè)器具有靈敏度高、選擇性好等特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣品中農(nóng)藥殘留的高靈敏度定性和定量分析，因此近年來(lái)在農(nóng)藥殘留分析中應(yīng)用非常廣泛。

2003年Anastassiades等[7]提出一種QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）方法，該方法用于水果和蔬菜樣品中的農(nóng)藥殘留分析，具有快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、有效、穩(wěn)定和安全等特點(diǎn)。QuEChERS方法采用乙腈作為最初的提取溶劑，加無(wú)機(jī)鹽后通過(guò)鹽析作用實(shí)現(xiàn)了有機(jī)相和水相的完全分離，避免了非極性溶劑的液液分配萃取步驟。一部分的提取液通過(guò)分散固相萃取（dSPE）凈化，離心除去吸附劑后濃縮定容或直接進(jìn)行下一步分析。目前研究表明，N-丙基-乙二胺鍵合硅膠（PSA）吸附劑具有弱的陰離子交換能力，有利于吸附樣品基質(zhì)中的有機(jī)酸、糖以及色素，在蔬菜的農(nóng)藥殘留分析中應(yīng)用非常廣泛[8，9]。同時(shí)，C18用于去除稻米提取液中的脂類物質(zhì)效果較好。因此，在本研究中，將PSA和C18作為QuEChERS方法的吸附劑，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）的分離檢測(cè)，建立了一種水稻糙米中吡唑醚菌酯殘留量的檢測(cè)方法。該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高，符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求，為開(kāi)展水稻中農(nóng)藥吡唑醚菌酯的殘留試驗(yàn)提供了有效的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水稻樣品取自農(nóng)藥殘留田間試驗(yàn)的樣品，采用四分法取樣。稻穗經(jīng)脫粒，去殼分離得到糙米，粉碎后置于-18 ℃保存，待測(cè)。吡唑醚菌酯標(biāo)樣購(gòu)自上海農(nóng)藥研究所，N-丙基-乙二胺鍵合硅膠（PSA）和C18鍵合硅膠購(gòu)自博納艾杰爾公司，色譜純的甲醇、乙腈、甲酸購(gòu)自美國(guó)Tedia公司，其他試劑均為分析純，去離子水由Milli-Q純水儀（Millipore， USA）制備。

1.2 主要儀器

ACQUITYTM超高效液相色譜儀-XevoTMTQ-S三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（Waters，美國(guó)）；SK8200LH超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；Anke TDL-40B型離心機(jī)（上海安亭儀器廠）；IKA MS1 Minishake漩渦振蕩器（IKA，德國(guó)）；BSA2202S電子天平（Sartorius，德國(guó)）；Milli-Q純水儀（Millipore，美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 色譜分析 色譜柱：ACQUITY UPLC@BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）（Waters，Belgium）；流動(dòng)相：甲醇/0.1%甲酸（30/70，V/V），流速為0.25 mL/min；柱溫：40 °C；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 質(zhì)譜分析 ESI正離子模式，離子源溫度150 ℃，脫溶劑氣溫度500 ℃，脫溶劑氣流量1 000 L/Hr，毛細(xì)管電壓3.0 kV，在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）下采集數(shù)據(jù)。首先采用流動(dòng)注射的方式將目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液直接注入質(zhì)譜儀中，在m/z 50～500內(nèi)全掃描，得到一級(jí)質(zhì)譜圖的準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+作為前體離子；然后進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，對(duì)錐孔電壓和碰撞能量?jī)?yōu)化，選擇豐度較高的兩個(gè)碎片離子作為定量和定性離子對(duì)。具體參數(shù)如表1所示。

1.3.3 樣品前處理

稱取已粉碎的糙米樣品5.0 g于100 mL離心管中，添加5.0 g無(wú)水硫酸鈉，渦旋混合，加入15 mL乙腈，高速勻漿2 min，振蕩器上振蕩30 min后，于3 500 r/min下離心5 min，待凈化。準(zhǔn)確吸取上層乙腈提取液1.5 mL于預(yù)先已加入150 mg無(wú)水MgSO4、50 mg PSA、50 mg C18的離心管中，渦旋30 s，離心，取上層清液，過(guò)0.45 μm濾膜，待檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

吡唑醚菌酯分子結(jié)構(gòu)中含有氮雜環(huán)，在ESI源的正離子模式下容易形成[M+H]+母離子。同時(shí)，相比于傳統(tǒng)的高效液相色譜（HPLC），UPLC具有更短的分離時(shí)間和更高的分離效率。因此，本研究選擇UPLC-ESI-MS/MS檢測(cè)樣品中的吡唑醚菌酯，與此同時(shí)，在水相中加入0.1%甲酸可顯著提高分析物的離子化效率，有效地提高目標(biāo)分析物的靈敏度。圖1為吡唑醚菌酯的典型MRM譜圖。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

由于稻米的基質(zhì)成分復(fù)雜，含有大量的淀粉、脂類物質(zhì)和蛋白質(zhì)，因此有必要對(duì)QuEChERS提取液進(jìn)行進(jìn)一步的凈化。PSA可吸附脂肪酸和一些糖類物質(zhì)，而C18可除去提取液中非極性的脂類物質(zhì)。本研究采用PSA和C18凈化提取液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.5 mL提取液中加入50 mg的PSA和50 mg的C18可以較好地除去基質(zhì)對(duì)分離檢測(cè)的干擾，同時(shí)可以獲得令人滿意的萃取回收率。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

在復(fù)雜樣品的分析中，基質(zhì)效應(yīng)會(huì)嚴(yán)重影響UPLC-MS/MS定量分析的結(jié)果。因而在建立UPLC-MS/MS檢測(cè)方法時(shí)應(yīng)考慮基質(zhì)效應(yīng)的影響，并采取措施進(jìn)行消除，從而保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。基質(zhì)效應(yīng)是指由于共洗脫雜質(zhì)分子的干擾而導(dǎo)致目標(biāo)分析物信號(hào)的增強(qiáng)或減弱，從而使分析結(jié)果不可靠，分析靈敏度降低等問(wèn)題[9]。在本研究中，通過(guò)比較分析物在溶劑和2種基質(zhì)中響應(yīng)的比值來(lái)考察基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果表明分析物在2種基質(zhì)和溶劑中的響應(yīng)基本一致，表明基質(zhì)效應(yīng)很弱。弱的基質(zhì)效應(yīng)表明該法的凈化效果較好，可以除去大部分的干擾物質(zhì)，減弱了基質(zhì)效應(yīng)。因此，本研究采用溶劑校準(zhǔn)曲線來(lái)分析稻米中的吡唑醚菌酯殘留量。

2.4 線性范圍和檢出限

稱取0.025 g吡唑醚菌酯標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容，得到1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再依次將其稀釋成0.50、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，取以上標(biāo)準(zhǔn)工作液各1 μL進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸。吡唑醚菌酯的回歸方程為y=5 893x+ 16 162，R2為0.990 0。以3倍信噪比計(jì)算最低檢測(cè)量，吡唑醚菌酯的最低檢測(cè)濃度為0.005 mg/kg。結(jié)果表明分析物在0.01～0.5 mg/L濃度范圍內(nèi)呈較好線性關(guān)系，同時(shí)方法靈敏度較高，可滿足實(shí)際樣品檢測(cè)要求。

2.5 回收率、精密度和最小檢測(cè)濃度

在未施用農(nóng)藥吡唑醚菌酯的稻田采集空白水稻糙米樣品，分別進(jìn)行3個(gè)水平的加標(biāo)回收率試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。從表2可見(jiàn)，稻米中吡唑醚菌酯在低、中、高3種添加濃度的加標(biāo)回收率為106%，96%和82%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為5.2%，3.5%和11.0%，表明方法具有很好的準(zhǔn)確度和精密度，可以滿足實(shí)際樣品分析檢測(cè)的要求。

2.6 樣品分析

吡唑醚菌酯懸浮劑以100 g.ai/hm2分別施藥2和3次，距最后一次施藥間隔21 d和28 d，采集水稻的稻穗樣品，經(jīng)脫殼后分離得到糙米樣品，糙米中的吡唑醚菌酯殘留按上述方法提取、凈化及檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。糙米中的殘留量在0.006～0.023 mg/kg，殘留量較低，表明農(nóng)藥按照這個(gè)劑量和采收期施藥對(duì)人體健康的威脅較小。

3 小結(jié)

QuEChERS法具有快速、簡(jiǎn)單、廉價(jià)、有效、穩(wěn)定和安全等特點(diǎn)，是目前各種食品樣品中農(nóng)藥殘留分析最常用的分析方法。本研究采用QuEChERS方法處理土壤樣品，結(jié)合UPLC-MS/MS分離檢測(cè)，建立了一種糙米中吡唑醚菌酯的快速、高效、靈敏的分析方法。對(duì)所建立的方法進(jìn)行了考察，包括基質(zhì)效應(yīng)、線性、檢出限、回收率和精密度等，結(jié)果表明該方法符合農(nóng)藥殘留分析的要求，可作為農(nóng)藥殘留試驗(yàn)和日常檢測(cè)糙米樣品中吡唑醚菌酯的檢測(cè)方法。

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