金屬離子介導下歐前胡素和異歐前胡素與人血白蛋白的相互作用

金屬離子介導下歐前胡素和異歐前胡素與人血白蛋白的相互作用

仝月菊，郝娟，付正卿，王娟，韓冬，張愛平

(山西醫科大學藥學院，山西 太原 030001)

摘要：目的在模擬人體生理條件下，獲得7種金屬離子介導下，歐前胡素和異歐前胡素與人血白蛋白(HSA)相互作用的熒光猝滅強度、結合位點數、結合常數、作用力類型及對其空間構象的影響。方法采用熒光光譜法和同步熒光光譜法結合，研究金屬離子介導下，歐前胡素和異歐前胡素與HSA的相互作用。結果金屬離子介導下，歐前胡素和異歐前胡素對HSA的熒光猝滅增強，同時結合作用增強。作用力主要為氫鍵和范德華力，不同金屬離子介導下其作用力類型不變，但作用力強弱有所改變。對于歐前胡素作用力順序為：Mg2+>Cu2+>Ni2+>Co2+>Zn2+>Fe3+>Al3+，異歐前胡素作用力順序為：Cu2+>Zn2+>Fe3+>Co2+>Mg2+>Al3+>Ni2+。同步熒光光譜結果顯示金屬離子介導下，歐前胡素和異歐前胡素與HSA相互作用后，HSA的構象均發生改變。結論金屬離子的存在促進歐前胡素和異歐前胡素與人血白蛋白相互作用。

關鍵詞：金屬離子；人血白蛋白；歐前胡素；異歐前胡素；熒光光譜法；同步熒光光譜法

基金項目：山西省自然科學基金資助項目(No.2010011048-1)；山西醫科大學科技創新基金(No.01200806)

作者簡介：仝月菊，女，研究方向：藥物小分子與生物大分子的相互作用，E-mail：minfriendtong@163.com

通訊作者：張愛平，女，教授，研究方向：藥物小分子與生物大分子的相互作用，Tel:13834679353，E-mail：zhangap1@163.com

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：A

The interaction of imperatorin and isoimperatorin with HSA in the presence of metal Ions

TONGYue-ju,HAOJuan,FUZheng-qing,WANGJuan,HANDong,ZHANGAi-ping

(DepartmentofPharmacy,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China)

Abstract：ObjectiveTo obtain the intensity of fluorescence quenching,binding-site number,binding constant,the influence of reaction type and its effect on the space conformation under simulated human physiological conditions.MethodsThe interaction of imperatorin and isoimperatorin with human serum albumin (HSA) were investigated using the fluorescence spectroscopy and synchronous fluorescence spectroscopy in the presence of metal ions.ResultsImperatorin and isoimperatorin enhanced the fluorescence quenching of HSA in the presence of metal ions,as well as conjugation.The hydrogen bond and vander waals force were the major driving force between the imperatorin,imperatorin and HSA.Their strength of force was changed,but the type of driving force unchanged in the presence of different metal ions.For the imperatorin,the order of force strength was Mg2+>Cu2+>Ni2+>Co2+>Zn2+>Fe3+>Al3+,for isoimperatorin,the order was Cu2+>Zn2+>Fe3+>Co2+>Mg2+>Al3+>Ni2+.The results of synchronous fluorescence spectroscopy indicated that the conformation of HSA was changed by imperatorin or isoimperatorin in the presence of metal ions.ConclusionThe presence of metal ions promoted the imperatorin and isoimperatorin interact with human serum albumin.

Key words:Metal ions;Human serum albumin;Imperatorin;Isoimperatorin;Fluorescence spectroscopy;Synchronous fluorescence spectroscopy

圖1　歐前胡素(A)和異歐前胡素(B)的結構

歐前胡素(imperatorin)和異歐前胡素(isoimperatorin) 均具有抗病毒、抗腫瘤和抗炎等作用，只是二者藥效強弱不同[1～3]，其結構式見圖1。歐前胡素和異歐前胡素進入人體后首先與人血白蛋白(HSA)結合，進而影響其在人體內的吸收、分布、轉運和代謝[4]。然而人體是一個復雜的生命體系，其中含有多種金屬離子，這些金屬離子既可與歐前胡素或異歐前胡素結合，又會與人血白蛋白結合，進而影響其相互作用。因此有關金屬離子介導下對歐前胡素和異歐前胡素與人血白蛋白的相互作用越來越受到關注。開展歐前胡素/異歐前胡素-金屬離子-HSA三元體系的研究對于指導患者合理用藥及對新藥的設計研究與開發等均具有重要的指導意義[5～8]。

本實驗在模擬人體生理條件下，以Mg2+等7種金屬離子為研究對象，采用熒光光譜法與同步熒光光譜法，考察金屬離子介導下，歐前胡素及異歐前胡素與人血白蛋白的相互作用。

1材料與方法

1.1實驗儀器與試劑

1.1.1儀器Cary Eclipse熒光光度計 (Peltier電子恒溫裝置，美國Varian公司)；TU-1901紫外可見分光光度計 (北京普析通用儀器有限責任公司)；AL-104型電子天平[Mettler Toledo 儀器 (上海) 有限公司]；pHS-3C型酸度計(上海雷磁儀器廠)。

1.1.2試劑歐前胡素、異歐前胡素(純度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司，批號:A0011、A0012)；其他試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2實驗方法

1.2.1溶液配制配制Tris-HCl 緩沖溶液 (pH 7.40，內含0.10 mol·L-1的NaCl)，用該緩沖溶液配制2.02×10-4mol·L-1HSA儲備液；用甲醇配制 1.96×10-3mol·L-1歐前胡素儲備液和 2.07×10-3mol·L-1異歐前胡素儲備液，用時根據需要稀釋。

1.2.2熒光光譜的測定將歐前胡素或異歐前胡素與金屬離子按物質的量之比1∶1配成二元體系(歐前胡素/異歐前胡素-Mn+)溶液，移取2.02×10-6mol·L-1HSA溶液2.0 mL于1 cm石英池中，用二元體系溶液對HSA溶液進行熒光滴定，差減相應的歐前胡素或異歐前胡素的光譜，在Cary Eclipse熒光光度計上記錄290～500 nm波長范圍內的發射光譜。

固定HSA溶液的濃度，逐漸滴加二元體系(歐前胡素/異歐前胡素-Mn+)溶液，差減相應濃度的歐前胡素或異歐前胡素的光譜，分別在Δλ=15 nm和Δλ=60 nm下掃描熒光激發光譜，得到HSA中酪氨酸殘基和色氨酸殘基的同步熒光光譜。

2結果

2.1金屬離子介導下歐前胡素和異歐前胡素對HSA的熒光猝滅固定HSA的濃度為2.02×10-6mol·L-1，將歐前胡素或異歐前胡素與金屬離子按物質的量之比1∶1配成二元體系(歐前胡素/異歐前胡素-Mn+)溶液，逐漸滴加二元體系溶液，用pH 為7.40的Tris-HCl緩沖溶液定容，搖勻，差減相應濃度的歐前胡素或異歐前胡素的光譜，在290～500 nm范圍內掃描熒光發射光譜，以Mg2+為代表附圖，結果見圖2，其余金屬離子的熒光猝滅光譜圖與之類似，本文所用熒光強度均為考慮稀釋效應后的值。

圖2　Mg 2+介導下，歐前胡素和異歐前胡素對HSA猝滅熒光光譜圖

注：CHSA：2.02×10-6mol·L-1,C歐前胡素/異歐前胡素=Mg2+(a→i)：0.00、0.20、0.40、0.58、0.95、1.31、1.65、2.14、2.61(×10-6mol·L-1)

由圖2可知，Mg2+介導下，隨著歐前胡素或異歐前胡素溶液濃度的增加，HSA的內源熒光強度均有規律地降低，但發射峰位和峰型基本不變[9]，說明金屬離子的存在使得兩種呋喃香豆素類藥物對HSA的熒光猝滅作用增強。

2.2金屬離子介導下，歐前胡素和異歐前胡素與HSA作用的結合位點數和結合常數的確定在靜態猝滅[10]作用中，熒光強度與猝滅劑的關系可由公式(2-1)表示[11]：

lg (F0-F)/F= lgK+nlg[Q]

(2-1)

F0和F分別為人血白蛋白和藥物作用前后的熒光強度，[Q]為藥物的濃度，K表示藥物與人血白蛋白相互作用的結合常數。

以lg(F0-F)/F對lg[Q]作圖，結果見圖3，以Mg2+為代表附圖，其余離子的雙對數圖與之類似。

圖3　Mg 2+介導下，不同溫度下歐前胡素和異歐前胡素 對HSA的雙對數圖(a:298K；b:303K；c:308 K)

由圖3中直線的斜率和截距可求出，Mg2+介導下，歐前胡素和異歐前胡素與HSA分子的結合位點數n和結合常數K，同理也可求出其他金屬離子介導下的結合位點數n和結合常數K，結果見表1。

表1　7種金屬離子介導下，歐前胡素和異歐前胡素

由表1可知，金屬離子介導下，歐前胡素和異歐前胡素與HSA作用結合位點數均接近于1，結合常數均增大，但不同金屬離子介導下作用力強弱有所不同。對于歐前胡素其作用力順序為：Mg2+>Cu2+>Ni2+>Co2+>Zn2+>Fe3+>Al3+>空白，對于異歐前胡素其作用力順序為：Cu2+>Zn2+>Fe3+>Co2+>Mg2+>Al3+>Ni2+>空白。

在歐前胡素(異歐前胡素)-Mn+-HSA三元體系中，金屬離子可能通過以下4種途徑參與歐前胡素(異歐前胡素)與HSA的結合過程(見圖4)。

圖4　金屬離子參與歐前胡素/異歐前胡素 與HSA的結合模式

以上4種過程體現了歐前胡素(異歐前胡素)-Mn+-HSA相互作用過程中Mn+的可能參與途徑。

2.3金屬離子介導下，歐前胡素和異歐前胡素與HSA結合的熱力學參數和作用力類型的確定藥物等小分子和蛋白質等生物大分子之間的結合力主要有疏水作用力、氫鍵、范德華力和靜電引力[12]等，不同藥物與蛋白的結合力類型是不同的。當溫度變化不大時，反應的焓變ΔH可視為常數，根據熱力學公式[13]可計算藥物小分子與生物大分子結合過程的有關熱力學參數。

ln(K2/K1)=ΔH(1/T1-1/T2)/R

(2-2)

ΔG=-RTlnK

(2-3)

ΔS=(ΔH-ΔG)/T

(2-4)

可分別得到不同溫度下藥物與人血白蛋白相互作用的焓變ΔH、熵變ΔS和生成自由能變ΔG。

根據藥物與蛋白相互作用的相關熱力學參數，可以判斷二者的作用力類型。若ΔH>0，ΔS<0，則分子間作用力主要為靜電作用和疏水作用力；若ΔH<0，ΔS<0，分子間作用力主要為范德華力和氫鍵；若ΔH<0，ΔS>0，則分子間作用力主要為靜電作用力；若ΔH>0，ΔS>0，分子間作用力主要為疏水作用力[14]。

金屬離子介導下，歐前胡素和異歐前胡素與HSA的熱力學參數見表2。

由表2知，ΔH、ΔS均小于0，表明金屬離子存在時，歐前異歐前胡素與HSA的相互作用力類型沒有改變，均為范德華力和氫鍵。

2.4金屬離子介導下，歐前胡素和異歐前胡素對HSA構象的影響蛋白質的熒光主要來自色氨酸和酪氨酸殘基。當Δλ=15 nm時，所得同步熒光光譜只顯示酪氨酸殘基的特征熒光；Δλ=60 nm時，所得同步熒光光譜只顯示色氨酸殘基的特征熒光[15，16]。而色氨酸、酪氨酸殘基的最大發射波長與其所處的微環境密切相關，據此考察蛋白質構象變化情況。

固定HSA的濃度，逐漸增加二元體系(歐前胡素/異歐前胡素-Mn+)溶液，分別固定Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，可得HSA中酪氨酸和色氨酸殘基的同步熒光光譜，實驗結果表明，歐前胡素和異歐前胡素與HSA在不同金屬離子的介導下所得的同步熒光光譜圖相似，故以Mg2+為代表附圖，結果見圖5。

表2　七種金屬離子對歐前胡素和異歐前胡素與HSA熱力學參數的影響

圖5　Mg 2+介導下，歐前胡素和異歐前胡素 與HSA作用的同步熒光光譜圖

注：CHSA:2.02×10-6mol·L-1,C歐前胡素/異歐前胡素=Mg2+(a→i):0.00、0.20、0.40、0.58、0.95、1.31、1.65、2.14、2.61(×10-6mol·L-1)

圖5結果顯示，金屬離子介導下，HSA中酪氨酸和色氨酸殘基的熒光同時被淬滅，其中色氨酸殘基的熒光強度降低更顯著，推測歐前胡素和異歐前胡素與HSA的結合位點更接近色氨酸殘基。同時HSA中色氨酸和酪氨酸的最大發射波長均發生紅移，表明歐前胡素和異歐前胡素的加入均使HSA中色氨酸殘基附近的極性增強，疏水性環境減弱，肽鏈的伸展程度有所增加，即加入金屬離子后，歐前胡素和異歐前胡素與HSA相互作用，HSA的構象均發生變化。

3討論

本實驗研究結果表明7種金屬離子的介導促進了歐前胡素及異歐前胡素與HSA的相互結合，但不同金屬離子介導下其相互作用力的強弱不同：對于歐前胡素其作用力順序為：Mg2+>Cu2+>Ni2+>Co2+>Zn2+>Fe3+>Al3+>空白，對于異歐前胡素其作用力順序為：Cu2+>Zn2+>Fe3+>Co2+>Mg2+>Al3+>Ni2+>空白。由此可知：7種金屬離子介導下，歐前胡素/異歐前胡素-Mn+-HSA的結合常數均增大，即K(歐前胡素/異歐前胡素-Mn+-HSA>K(空白)，表明金屬離子促進了歐前胡素和異歐前胡素與人血白蛋白的相互作用，推測金屬離子可能以途徑三參與其相互作用，起“離子架橋”的作用[17]，促進歐前胡素和異歐前胡素與HSA的結合，使得歐前胡素、異歐前胡素在血漿中潴留時間相應延長，釋放更緩慢，可減小其毒副作用。

不同金屬離子介導下，歐前胡素/異歐前胡素-Mn+-HSA的作用力強弱不同，即結合常數大小不同，也可以看做是穩定性不同。

第一過渡系二價金屬離子形成配合物的穩定性順序為Zn2+>Cu2>Ni2+>Co2+>Fe2+，此為Irving-Williams序列[18]，歐前胡素-Mn+-HSA三元體系的穩定性順序基本與其一致，由金屬離子介導下，歐前胡素與HSA作用強弱順序可知，Mg2+與歐前胡素和人人血白蛋白的結合能力較強，即Mg2+介導下，可以促進歐前胡素與HSA的結合作用，也就是說可以延長其在人體內的作用時間，而Mg2+和歐前胡素均對心腦血管疾病的防治有著重要的作用[19]，因此在服用此類藥物時，應注意對Mg2+的攝取量，使其既能發揮最大藥效，又能避免其毒副反應。

對于異歐前胡素，其穩定性順序不符合Irving-Williams序列，推測可能是Fe3+的3d5半滿和Cu2+、Zn2+3d10全滿均為穩定狀態，二者受配位場的影響較小，因此作用力比較強。Al3+對歐前胡素和異歐前胡素與HSA結合作用的影響均較小，但Al3+對于人體有害，應該盡量避免其攝入。

相同金屬離子介導下，其對歐前胡素和異歐前胡素與HSA的促進作用也不相同。由表1知，Mg2+、Co2+、Fe3+、Ni2+對歐前胡素與HSA結合的促進作用較異歐前胡素與HSA結合的促進作用強，而Zn2+、Cu2+、Al3+則恰好相反。7種金屬離子中，Mg2+和Ni2+兩種金屬離子介導對歐前胡素和異歐前胡素與HSA的結合促進作用差異較大，而Cu2+的介導對兩種藥物與HSA相互作用結合促進作用相差不大。

參考文獻：

[1] 楊小花,胡曉.歐前胡素和異歐前胡素的藥理學研究進展[J].南昌大學學報(醫學版),2012,52(3):95-97.

[2] 胡華杰,樓召歡,呂圭源,等.HPLC法測定不同產地白芷飲片中歐前胡素和異歐前胡素的含量[J].浙江中醫藥大學學報,2010,34(3):418-419.

[3] 張愛平,郝娟,黃茜,等.歐前胡素及同分異構體與DNA的作用機理及構效關系研究[J].分子科學學報,2012,28(1):36-42.

[4] 王寧,劉忠英,胡秀麗,等.黃芩類藥物與人血清白蛋白的相互作用[J].高等學校化學學報,2011,32(2):241-245.

[5] Zhang GW,Chen XX,Guo JB,et al.Spectroscopic investigation of the interaction between chrysie and bovine serum albumin[J].J Mol Struct,2009,921(1-3):346-351.

[6] Zhang YH,Yue YY,Li JZ,et al.Studies on the interaction of caffeic acid with human serum albumin in membrane mimetic environments[J].J Photochem Photobiol B,2008,90(3):141-151.

[7] 張海蓉,邊賀東,潘英明,等.光譜法研究兒茶素與牛血清白蛋白的相互作用[J].光譜學與光譜分析,2009,29(11):3052-3056.

[8] Faizul FM,Kadir HA,Tayyab S.Spectroscopic studies on the binding of bromocresol purple to different serum albumins and its bilirubin displacing action[J].J Photochem Photobiol B,2008,90(1):1-7.

[9] 屈冉,張驍,張鵬.L-瓜氨酸與牛血清白蛋白相互作用的研究[J].北京化工大學學報(自然科學版),2012,39(1):77-82.

[10] 王迎進,張艷青,李亞雄,等.光譜法研究根皮苷與人血清白蛋白的相互作用[J].分析測試學報,2013,32(2):239-243.

[11] 袁道琴,馮素玲,崔鳳靈.甘草酸二銨與牛血清白蛋白相互作用的光譜[J].應用化學,2009,26(8):918-922.

[12] 何文英,史載鋒,陳光英,等.光譜法與分子模擬表征2種呫噸酮類化合物鍵合人血清白蛋白[J].藥物分析雜志,2011,31 (1):59-65.

[13] 謝孟峽,徐曉云,王英典,等.4′,5,7-三羥基二氫黃酮與人血清白蛋白相互作用的光譜學研究[J].化學學報,2005,63 (22):2055-2062.

[14] 遲燕華,莊稼,丁飛.血清白蛋白與巴比妥鈉相互作用的光譜研究[J].分析測試學報,2007,26(5):658-661.

[15] Bi SY,Pang B,Wang TJ,et al.Investigation on the interactions of clenbuterol to bovine serum albumin and lysozyme by molecular fluorescence technique[J].Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc,2014,120:456-461.

[16] Bhogale A,Patel N,Sarpotdar P,et al.Systematic investigation on the interaction of bovine serum albumin with ZnO nanoparticles using fluorescence spectroscopy[J].Colloids Surf B Biointerfaces,2013,102:257-264.

[17] Liu XF,Xia YM,Fang Y.Effect of metal ions on the interaction between bovine serum albumin and berberine chloride extracted from a traditional Chinese Herb coptis chinensis franch[J].J Inorg Biochem,2005,99(7):1449-1457.

[18] 劉雪峰,李磊,方云,等.中草藥成分七葉內酯-BSA-金屬離子的相互作用[J].化學研究與應用,2007,19(2):145-149.

[19] 洪炳哲,樸海南,李勝范,等.血管內皮生成因子165誘導血管形成中鎂離子作用的研究[J].中華心血管病雜志,2007,35(3):260-264.