穿膜肽介導紫杉醇脂質體對腫瘤的治療作用

穿膜肽介導紫杉醇脂質體對腫瘤的治療作用

趙海偉，何偉，尹莉芳

(中國藥科大學藥學院藥劑教研室，江蘇 南京 210009)

摘要：目的制備和表征F3修飾紫杉醇脂質體，并進行細胞學和體內抗腫瘤評價。方法 采用薄膜分散法制備脂質體，人肺腺癌細胞A549進行攝取評價；小鼠肝癌細胞H22荷瘤小鼠進行體內抗腫瘤活性評價。結果F3修飾脂質體粒徑為90 nm；該修飾后脂質體被細胞攝取能力明顯增強，進而提高了藥物的抗腫瘤活性，給藥16天后，F3-Lipo組瘤體增長僅為11倍，相比于生理鹽水組26倍，Taxol 18倍，未修飾脂質體14倍，有更好的抗腫瘤效果。結論F3穿膜肽可以明顯提高載體入胞能力，進而改善藥物治療作用。

關鍵詞：穿膜肽；脂質體；紫杉醇；細胞攝取；抗腫瘤

基金項目：國家自然科學基金(No.81473152)

作者簡介:趙海偉，女，碩士研究生，研究方向：緩控釋制劑的開發與研究，E-mail:zhaohw322@163.com

通訊作者：尹莉芳，女，教授，博士生導師，研究方向：藥物新劑型與新技術，Tel:025-83271018,E-mail:lifangyin_@163.com

中圖分類號：R944.9文獻標識碼：A

Therapeutic ation of paclitaxel liposome mediated by penetrating peptides on tumor

ZHAOHai-wei,HEWei,YINLi-fang

(DepartmentofPharmaceutics,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China)

Abstract：ObjectiveTo prepare and exosyndrome F3 modified paclitaxel liposome and evaluate the cellular uptake and antitumor activities.Methods The liposomes were prepared by film-dispersed method;The studies of cellular uptake and antitumor activities were performed in A549 cells and H22-bearing mice,respectively.ResultsThe F3 modified liposomes with a diameter size of around 90 nm were uptaken by cells and thus had better antitumor activities.Conclusion F3 penetrating peptides could enhance the cellular uptake and thus improve the therapeutic outcome of drugs.

Key words:Penetrating peptides;Liposomes；Paclitaxel；Cellular uptake；Antitumor activities

據統計，到2030，全球每年的癌癥新增病例將超過1千萬，癌癥相關患病人數將達1.2千萬。腫瘤已經成為威脅人類健康的頭號敵人[1]。近年來，新型微粒遞藥系統如脂質體、納米乳、聚合物膠束等顯示了其在腫瘤治療領域的獨特治療優勢。因為該類系統不僅可以通過增強滲透滯留效應(Enhanced Permeability and Retention effect,EPR效應)增加藥物在病灶的蓄積，還可以明顯降低藥物對正常組織的毒性[2～7]。

脂質體(Liposome，Lipo)是由天然的或合成脂質通過自組裝形成的具有閉合結構的雙分子囊泡[7]。該類載體由于其構成與細胞膜相似，因而具有理想的生物相容性。與其他載體相比，Lipo不僅適合包載難溶性藥物，對水溶性藥物也具有很好的包封作用。由于Lipo具有完全閉合的結構，可以明顯提供藥物的穩定性[8]。

細胞穿膜肽是目前國際研究最為熱門的靶基，主要因為穿膜肽不僅自身能透過多種細胞膜,而且還可有效攜帶比其相對分子質量大100倍的外源性疏水大分子進入活細胞，這種高效率的細胞穿膜肽對宿主細胞沒有顯著毒副作用。但是，普通穿膜肽對正常組織也有很強的穿透性，不但降低其載體對腫瘤的靶向性，同時也會導致藥物在正常組織蓄積進而引起毒副作用。核仁蛋白，是一組穿梭于細胞表面與細胞核之間的蛋白，它在各種腫瘤細胞表面及腫瘤新生血管內皮細胞均高表達，但只存在于正常細胞的細胞核，由于對腫瘤新生血管及腫瘤細胞的有效性與特異性雙重靶向及其高效的細胞內化，使其成為一個極具吸引力的靶點。 含31個氨基酸的小肽F3(CKDEPQRRSARLSAKPAPPKPEPKPKKAPAKK)能特異性識別細胞表面的核仁素蛋白，并從細胞表面有效轉運至細胞核；同時，F3對腫瘤組織有很強的穿透力，介導載體深入瘤體內部，有效增加藥物在病變部位的蓄積[9]。

PTX是臨床最常用的廣譜抗癌藥物之一。目前，紫杉醇是唯一能促微管聚合的藥物，通過穩固微管，阻礙紡錘體形成，使得染色體向兩極移動，進而將分裂細胞周期阻滯于G2/M期[10,11]。此外，PTX還有誘導細胞凋亡、激活免疫系統、誘導腫瘤壞死因子TNF-α生成等功能。但PTX的用藥依然面臨以下問題[12,13]：①在水中的溶解度極低，致使其給藥困難；②普通給藥方式不具備靶向性，除了導致藥物在靶部位無法有效蓄積外，也會大量分布至其它正常組織和器官，進而導致很大的毒副作用。因此，本研究旨在利用F3對腫瘤的靶向性，構建F3修飾PTX脂質體(F3-Lipo)，進而提高PTX對腫瘤的治療作用，降低毒性。

1材料與方法

1.1試劑與細胞株紫杉醇(Taxol)(批號:20130901，江蘇紅豆杉藥業有限公司)；F3(上海吉爾生化有限公司)；膽固醇(中國慧興生化試劑有限公司)；大豆磷脂S100PC(790636-09/901,德國LIPOID)；甲氧基化聚乙二醇二硬脂酸磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE),馬來酰亞胺化聚乙二醇二硬脂酸磷脂酰乙醇胺(Mal-PEG-DSPE),均購自美國Avanti polar lipids公司；甲醇(色譜純,上海凌峰化學試劑有限公司)；氯仿(分析純,上海凌峰化學試劑有限公司)；胎牛血清 (浙江天杭生物科技有限公司)；RPMI1640 培養基(美國Hyclone公司)；胰蛋白酶(美國Hyclone 公司)；磷酸鹽緩沖液PBS(美國Hyclone 公司)；H22和A549細胞株(南京凱基生物科技發展有限公司)；雄性ICR小鼠(18～22 g，揚州大學比較醫學中心 [許可證號：SCXK(蘇) 2012-0004]；香豆素-6(C-6)(美國西格瑪奧德里奇公司)。

1.2儀器精密電子天平(德國賽多利斯有限公司)；KQ-200KDE超聲波清洗器(昆山舒美超聲儀器有限公司)；RE52CS旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；Zetasizer Nano ZS粒徑測定儀(英國Malvern 儀器公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵(鞏義市裕華有限責任公司)；DZF-6020 型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)；TGL-16B 臺式高速離心機(上海安亭科學儀器廠)；超凈工作臺(美國Thermo有限公司)；CO2培養箱(上海躍進有限公司)；流式細胞儀(FACSCalibur，美國碧迪公司)。

1.3F3修飾脂質體制備與表征導向肽合成：按F3：DSPE-PEG-Mal=1.2∶1(mol/mol)的比例投料，F3溶于3 mL脫氣pH 7.4的PBS緩沖液中，DSPE-PEG-Mal溶于1 mL的二甲基亞砜DMSO中，再將DMSO溶液慢慢加入PBS溶液中，吹氮氣除去空氣，氮氣氛下冰浴下反應24 h。反應完后，產物移進透析袋(MWco=5 000)，冰浴透析24 h，其間前面22 h用PBS透析液，后2 h換成純凈水透析。

采用薄膜分散法制備F3-Lipo。制備過程為：將大豆磷脂∶膽固醇∶PTX∶mPEG-DSPE∶導向肽(按摩爾比為9∶1∶0.3∶0.5∶0.1)溶于氯仿甲醇混合溶劑中；35 ℃減壓旋蒸2 h，抽真空過夜，35 ℃下PBS水化30 min，冰浴下探頭超聲5 min。載探針C-6脂質體(C-6-Lipo)同法制得。

1.4細胞攝取生長良好的A549細胞消化離心后，吸棄上層廢液，加入新RPM1640培養基，計數，再以105·cm-2的密度接種于24孔板，于5% CO2培養箱中37 ℃培養24 h。

不同時間攝取：吸去培養基后，加入900 μL新培養基，加入相同濃度(高濃度)的C-6-Lipo或F3-Lipo，在37 ℃下孵育0.5、1、2、4 h，棄去廢液，加入PBS液體清洗3次，加入50 μL胰酶消化1 min，加入200 μL PBS停止消化，吹打分散細胞，流式細胞儀綠色熒光通道下檢測。

不同溫度和濃度攝取：吸去培養基，加入900 μL新培養基，分別加入100 μL高、低濃度的C-6-Lipo或F3-Lipo，在37 ℃或4 ℃孵育2 h后棄去上層液體，PBS清洗2次后熒光顯微鏡下觀察高低濃度下的熒光強弱。最后利用流式細胞儀進行定量測定。

1.5體內抗腫瘤活性H22細胞傳小鼠腹水，一周后，將腹水鼠處死，從腹腔處抽腹水，移入15 mL離心管中離心，將上層液體移去，加入生理鹽水清洗細胞，重復2次，移去上清液，加入生理鹽水，計數，按照計數結果，將細胞稀釋至1×107·mL-1，再以每只小鼠200萬量接于小鼠腋下。待瘤體長到1 cm3大小時開始給藥。荷瘤小鼠隨機分成4組，每組7只，分別為生理鹽水組、PTX注射液(Taxol)組、PTX-Lipo組和F3-PTX-Lipo組,PTX劑量為10 mg·kg-1。尾靜脈給藥，并分別測量小鼠瘤體大小。每3天給1次藥，每2天測量瘤體大小。

1.6統計學分析 數據用平均值±SD值表示，P<0.05時具有顯著性差異。

2結果

本文采用了薄膜分散法制備F3-Lipo和普通長循環脂質體。制備得到的脂質體粒徑約為90 nm，且多分散系數小于0.2，說明體系粒徑分布較窄(見圖1)。進一步通過透射電鏡檢測表明(見圖1)，所得粒子為球形，粒徑在50～100 nm范圍內，與光散射測定結果基本一致。

圖1　F3修飾脂質體的表征 A.粒徑及粒徑分布;B.透射電鏡掃描

熒光探針C-6包載的F3-Lipo和Lipo在A549細胞中的攝取見圖2。A549對F3-Lipo或Lipo的攝取隨著時間增加，攝取量增加；F3-Lipo或Lipo兩者相比，前者的攝取量在2 h后，A549對脂質體的攝取量明顯增加，表明F3穿膜肽可以明顯增加載體的內化作用,提高載體被細胞攝取的能力。

在4 ℃和37 ℃條件下，高低濃度C-6包載的F3- Lipo和Lipo在A549細胞中的攝取見圖3。在兩種溫度下，A549細胞對F3-Lipo或Lipo的攝取與濃度為正比關系，增加濃度，攝取量增加；同時也觀察到，細胞對F3-Lipo的攝取量明顯大于Lipo。

圖2　普通脂質體及F3修飾脂質體在不同時間點的細胞攝取量

圖3　普通脂質體及F3修飾脂質體在不同溫度下的細胞攝取

包載PTX的F3- Lipo和Lipo或市售產品Taxol的H22荷瘤小鼠體內的抗腫瘤活性見圖4。按照PTX劑量為10 mg·kg-1連續給藥16天后，瘤體體積增長倍數為生理鹽水組26倍，Taxol 18倍，未修飾Lipo 14倍，F3- Lipo 11倍，表明PTX制劑確實能明顯抑制腫瘤生長(P<0.05)；但制劑不同，其抗腫瘤效果差異明顯。其中脂質體與游離藥物相比，前者能進一步抑制腫瘤生長。當脂質體進一步被穿膜肽F3修飾后，其抗腫瘤作用進一步增強。

圖4　 H22荷瘤小鼠的腫瘤大小變化

3討論

本文成功制得了F3修飾PTX脂質體。在F3的介導下，PTX脂質體被細胞攝取的能力明顯增強，特別的是，在4 ℃條件下，細胞對高濃度的F3-Lipo同樣具有很好的攝取能力。一般而言，在低溫條件下(4 ℃)，由于細胞膜的難變形的特點，細胞對納米粒的攝取能力非常弱[14]。這就提示，一部分F3-Lipo有可能通過非經典內吞作用進入細胞[15]。

經F3修飾PTX脂質體后，制劑的抗腫瘤效果也增強了，主要是因為：①F3具有較強的腫瘤穿透作用。在F3的介導下，脂質體可以進一步滲透進入瘤體內部[16]；②F3與腫瘤細胞核仁素受體結合作用。脂質體表面的F3與細胞高表達的特異核仁素受體結合，進一步增強載體的入胞作用；特別是從圖3可知，F3有可能使得脂質體能繞過溶酶體-內涵體系統直接進入胞漿，有利于PTX發揮藥效(因為藥物的作用位點位于細胞漿)。總之，F3的介導能明顯改善載體的抗腫瘤作用。

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