小鼠尾靜脈注射玉葉金花皂苷U的急性毒性試驗(yàn)研究

通信作者：李嘉，女，副主任醫(yī)師，研究方向：植物化學(xué)，Tel:0771-5868986，E-mail:1343157882@qq.com

小鼠尾靜脈注射玉葉金花皂苷U的急性毒性試驗(yàn)研究

曾憲彪1，李嘉1,2，韋桂寧1，張穎2，韋寶偉1

(1.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530022；2.廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530022)

摘要：目的研究小鼠尾靜脈注射玉葉金花皂苷U的急性毒性反應(yīng)，測(cè)定經(jīng)該途徑給藥后，小鼠半數(shù)致死劑量及其99%可信限。方法小鼠尾靜脈注射玉葉金花皂苷U，預(yù)試出最大0%和最小100%致死劑量。然后，分別給10組小鼠尾靜脈注射，按1∶0.8等比稀釋的系列濃度溶液0.01 mL·g-1，劑量在最大0致死劑量和最小100%致死劑量之間，觀察給藥后15 d各組小鼠中毒死亡情況。結(jié)果給藥劑量在128～760 mg·kg-1之間時(shí)，最低、最高劑量組小鼠死亡率介于20%和70%之間，劑量對(duì)數(shù)與死亡概率單位之間呈近似線性關(guān)系。結(jié)論小鼠尾靜脈注射玉葉金花皂苷U半數(shù)致死劑量為286.327 mg·kg-1，其99%可信限為植物化學(xué)(286.327±76.189)mg·kg-1。

關(guān)鍵詞：玉葉金花皂苷U；小鼠；急性毒性；半數(shù)致死劑量

基金項(xiàng)目：廣西科技廳科技能力建設(shè)專項(xiàng)基金(No.桂科能12239004-2)；廣西衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項(xiàng)基金(No.GZPT13-30)；廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任基金(No.桂中重科201106)

作者簡(jiǎn)介：曾憲彪，男，助理研究員，研究方向：藥理學(xué)，E-mail:zxb51963@163.com

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Acute toxicity experimental study of mussaendoside U administered by caudal vein injection in mice

ZENGXian-biao1,LIJia1,2,WEIGui-ning1,ZHANGYing2,WEIBao-wei1

(1.InstituteofTraditionalMedicalandPharmaceuticalSciencesofGuangxiZhuangAutonomous

Region，Nanning530022，China;2.GuangxiKeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicine

QualityStandards，Nanning530022,China)

Abstract：ObjectiveTo study the acute toxicity reaction and determine the median lethal dose and its 99% confidence limit when mice were administered mussaendoside U by caudal vein injection.MethodsMice received administration by caudal vein injection of mussaendoside U,pilot test was carried out to look for minimum 0% lethal dose and maximum 100% lethal dose.And then,10 groups mice were injected mussaendoside U concentration according 1∶0.8 geometric dilution solution of 0.01 mL·g-1,dose of each group was between minimum 0 lethal dose and maximum 100% lethal dose.The situations of death by poisoning in each group within 15 days after the treatment were observed.ResultsThe death rates of lowest dose group and highest dose group were within 20%～70% while administration dose was 128～760 mg·kg-1.There was approximate linear relationship between logarithm of dosage and death probability.ConclusionThe median lethal dose of mice administered mussaendoside U by caudal vein injection was 286.327 mg·kg-1,and its 99% confidence limit was (286.327±76.189)mg·kg-1.

Key words:Mussaendoside U;Mice;Acute Toxicity;Median lethal dose

玉葉金花皂苷U(簡(jiǎn)稱：皂苷U，mussaendoside U)是從野生茜草科玉葉金花屬植物玉葉金花(MussaendapubescensAit.f.)[1,2]的根和莖提取分離的環(huán)阿屯烷型三萜皂苷[3]。Zhao WM等[4～6]報(bào)導(dǎo)與本品有相同苷元結(jié)構(gòu)的mussaendoside O，能抑制由卡巴膽堿引起的回腸肌收縮、抑制由加蘭他敏促進(jìn)的唾液腺和淚腺分泌，有抗膽堿作用。皂苷U也有同樣的抗膽堿作用，在抑制M膽堿能神經(jīng)興奮、松弛平滑肌、改善微循環(huán)、解有機(jī)磷等神經(jīng)毒劑中毒方面有積極效果。有關(guān)靜脈注射皂苷U急性毒性試驗(yàn)，至今未見(jiàn)有報(bào)導(dǎo)。本研究試驗(yàn)小鼠尾靜脈注射皂苷U的急性毒性反應(yīng)，為進(jìn)一步作皂苷U動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料

1.1試驗(yàn)藥物皂苷U是本課題組從廣西玉林等地8～10月份產(chǎn)野生玉葉金花干燥根莖提取分離的環(huán)阿屯烷型三萜皂苷結(jié)晶，對(duì)光穩(wěn)定，易溶于水，批號(hào)：20110503，取該結(jié)晶與mussaendoside U標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，批號(hào)：103T5331U)，經(jīng)用液相色譜法和溥層色譜法比較，認(rèn)定該晶體含mussaendoside U大于95%。

1.2試驗(yàn)動(dòng)物昆明小白鼠，體重(20±2)g，雌、雄各半，由廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK桂2009-0002。實(shí)驗(yàn)室溫度(23±2)℃。

2方法[7～9]

2.1預(yù)試驗(yàn)取質(zhì)量濃度為100 mg·mL-1的玉葉金花皂苷U，用生理鹽水稀釋成質(zhì)量濃度為50、25、12.5、6.25、3.125 mg·mL-1藥液。取6組小鼠，每組4只(雌雄各半，下同)。各組經(jīng)尾靜脈注射不同濃度藥液，每g體重0.020 mL，劑量分別為2 000、1 000、500、250、125、62.5 mg·kg-1。觀察給藥后15 d內(nèi)小鼠死亡情況。結(jié)果見(jiàn)1 000 mg·kg-1及其以上劑量組小鼠死亡4個(gè)；62.5 mg·kg-1劑量組小鼠0死亡。估計(jì)小鼠100%死亡劑量和0死亡劑量分別為1 000 mg·kg-1和62.5 mg·kg-1。再取8組小鼠，每組4只，按每克體重0.02(或0.019、0.015、0.010)mL注射量，經(jīng)尾靜脈注射質(zhì)量濃度為50(或25、12.5、6.25)mg·mL-1藥液，劑量分別為1 000、950、750、500、250、125、94 mg·kg-1。觀察記錄給藥后15 d內(nèi)各組動(dòng)物死亡情況，確立皂苷U小鼠最小100%死亡劑量和最大0死亡劑量分別為950 mg·kg-1和94 mg·kg-1。

2.2正式試驗(yàn)根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，在最大0%致死劑量(94 mg·kg-1)和最小100%致死劑量(950 mg·kg-1)之間設(shè)置10個(gè)劑量組，相鄰兩個(gè)高低劑量組間劑量比值設(shè)定為1∶0.8。取質(zhì)量濃度為100 mg·mL-1的玉葉金花皂苷U溶液，加生理鹽水稀釋成質(zhì)量濃度為95.0、76.0、60.8、48.6、38.9、31.1、24.9、19.9、15.9、12.8 mg·mL-1藥液各適量。取合格小白鼠，稱量給藥前體重后隨機(jī)分為1個(gè)對(duì)照組和10個(gè)試驗(yàn)組，每組10只。對(duì)照組尾靜脈注射生理鹽水0.01 mL·g-1，試驗(yàn)組按每克體重0.01 mL注射量，尾靜脈注射上述系列濃度藥液。給藥后第7、15天各稱量存活小鼠體重1次。觀察給藥后15 d內(nèi)各組小鼠死亡況。解剖全部中毒死亡小鼠及觀察期結(jié)束后存活小鼠，檢查心、肝、肺、腎、腦等主要器官。根據(jù)給藥后15 d內(nèi)小鼠死亡率查表找出各組小鼠死亡概率單位，給藥劑量換算成劑量對(duì)數(shù)，以概率單位為X軸，劑量對(duì)數(shù)為Y軸作圖檢查兩者線性關(guān)系。依據(jù)劑量對(duì)數(shù)與死亡概率單位關(guān)系確定LD50及其99%平均可信限的計(jì)算方法并計(jì)算。

3結(jié)果

部分小鼠尾靜脈注射給藥后15 min出現(xiàn)瞳孔擴(kuò)張，直接、間接對(duì)光反射遲鈍或消失等癥狀，之后相繼有小鼠死亡，死亡小鼠多集中出現(xiàn)在給藥后24 h內(nèi)，給藥后次日至觀察期結(jié)束無(wú)新增死亡，小鼠死亡無(wú)性別差異，未亡小鼠癥狀多在給藥后4 h消失。給藥后第7、15天，給藥組存活小鼠體重與對(duì)照組比較，P>0.05，組間差異無(wú)顯著性意義，各組小鼠死亡數(shù)與給藥劑量正相關(guān)，劑量越大，死亡越多，最高劑量組死亡率大于70%，最低劑量組死亡率小于30%(見(jiàn)表1)。當(dāng)給藥劑量在128～760 mg·kg-1，相應(yīng)劑量對(duì)數(shù)在2.105 5～2.880 8間，劑量對(duì)數(shù)與死亡概率單位之間呈近似線性關(guān)系，可以用綜合率法計(jì)算

表1　玉葉金花皂苷U小鼠急性毒性試驗(yàn)正式試驗(yàn)( n=10)

注：同時(shí)期試驗(yàn)組存活小鼠體重與對(duì)照組比較，P>0.05，組間差異無(wú)顯著性意義

LD50及其99%平均可信限。解剖檢查中毒死亡小鼠及觀察期結(jié)束后存活小鼠的心、肝、肺、腦、腎等主要臟器，光鏡下未見(jiàn)明顯的致死性病理變化。計(jì)算得LD50為286.327 mg·kg-1，小鼠半數(shù)致死劑量的99%平均可信限為(286.327±76.189)mg·kg-1。

半數(shù)致死劑量的99%平均可信限=LD50±5.9×LD50×Sx50。

4討論

本試驗(yàn)中當(dāng)給藥劑量在128～760mg·kg-1時(shí)，劑量對(duì)數(shù)與死亡概率單位之間呈近似線性關(guān)系，經(jīng)用綜合法計(jì)算得小鼠半數(shù)致死劑量為286.327mg·kg-1，說(shuō)明在該劑量附近，劑量稍有變化，小鼠死或活即有顯著性差異。皂苷U可能直接作用于M膽堿受體或重活化乙酰膽堿酯酶，從而阻斷M膽堿能神經(jīng)，引起一系列中樞或外周M膽堿能神經(jīng)沖動(dòng)傳遞障礙，嚴(yán)重的神經(jīng)沖動(dòng)傳遞障礙，必然影響心、腦及其他重要器官功能，小鼠急性中毒死亡可能和藥物引起多器官?gòu)V泛性或個(gè)別器官致死性功能衰竭有關(guān)。

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