HPLC法測定抗丙肝新藥CZYS-201402-04的有關物質(zhì)

HPLC法測定抗丙肝新藥CZYS-201402-04的有關物質(zhì)

陶鑫1，焦丹丹2，吳衛(wèi)忠3，張建軍4，余洛汀1

(1.四川大學生物治療國家重點實驗室，四川 成都 610041；2.常州寅盛藥業(yè)有限公司，江蘇 常州 213033；

3.常州大學，江蘇 常州 213164；4.中國藥科大學，江蘇 南京 210009)

摘要：目的采用高效液相色譜法測定新型丙型肝炎治療藥物CZYS-201402-04的有關物質(zhì)。 方法采用Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×100 mm, 3.5 μm)，用二元梯度洗脫的方式，流動相A為10 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液(pH 3.0)，流動相B為乙腈，檢測波長為210 nm，柱溫40 ℃，流速1.0 mL·min-1。結果CZYS-201402-04的峰能與相鄰雜質(zhì)峰完全分離。CZYS-201402-04定量限為0.039 ng(0.003 9 μg·mL-1)，最低檢出限為0.013 ng(0.001 3 μg·mL-1)。重復性RSD=1.5%(n=6)，中間精密度RSD=1.4%(n=9)。樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。結論該方法為CZYS-201402-04的有關物質(zhì)檢查提供了方便、靈活、精確、可靠的方法。

關鍵詞：高效液相色譜法； CZYS-201402-04；有關物質(zhì)

基金項目：“十二五”新藥創(chuàng)制科技重大專項(No.2012ZX09103101079);江蘇省科技支撐計劃—社會發(fā)展項目(No.BE2014626)

作者簡介：陶鑫，男，主管藥師，研究方向：藥物合成與質(zhì)量控制，E-mail:taoxinmeter@163.com

通訊作者：余洛汀,男，博士研究生，教授，博士生導師，研究方向：藥物化學、化學生物學和不對稱合成化學，Tel：028-85503817，E-mail：luodyu@163.com

中圖分類號：R927.1文獻標識碼：A

Determination of related substances of a novel anti-HCV drug CZYS-201402-04 by HPLC

TAOXin1,JIAODan-dan2,WUWei-zhong3,ZHANGJian-jun4,YULuo-ting1

(1.StateKeyLaboratoryofBio-therapyofSichuanUniversity,Chengdu610041,China;2.Changzhou

YinshengPharmaceuticalCo.,Ltd.,Changzhou213033,China;3.ChangzhouUniversity,Changzhou

213164,China;4.ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009，China)

Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of related substances of a novel anti-HCV drug CZYS-201402-04.MethodsZorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)column was used.The mobile phase A was water solution containing 10 mmol·L-1 potassium dihydrogen phosphate(pH 3.0)and the mobile phase B was acetonitrile.The UV detection wavelength was 210 nm,the column temperature was 40 ℃ and the flow rate was 1.0 mL·min-1.ResultsCZYS-201402-04 could be effectively separated with impurities.The LOQ was 0.039 ng (0.003 9 μg·mL-1) and LOD was 0.013 ng (0.001 3 μg·mL-1).RSD of repeatability was 1.4% and RSD of intermediate precision was 1.5%.The solution was stable in 24 h.Conclusion The method was convenient,sensitive,accurate and reliable for the determination of assay and related substances of CZYS-201402-04.

Key words:HPLC;CZYS-201402-04;Related substances

慢性丙型肝炎(Chronic Hepatitis C,CHC)是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)引起的一種傳染性肝臟疾病。目前全球約有2%的人感染了HCV，而每年約有35萬人死于丙型肝炎相關的疾病[1]。中國在1999年HCV感染率約為1.1%(1 400萬人)[2]，并且在最近幾年呈逐漸上升趨勢，每年新診斷病例接近20萬人。HCV的感染者經(jīng)過10～20年的潛伏期后，約有80%的人將發(fā)展為慢性丙型肝炎，20%的人將進一步發(fā)展成肝硬化，1%～4%的人將最終惡化轉(zhuǎn)變?yōu)楦伟3]。目前，臨床上用于丙型肝炎治療的直接抗病毒藥物大致可以分為3類：① NS3/4A抑制劑，包括Telaprevir、Boceprevir、Simeprevir等；②NS5A抑制劑，包括BMS公司開發(fā)的Daclatasvir[4]和Ombitasvir等；③NS5B抑制劑，包括Sofosbuvir和Dasabuvir等。臨床試驗顯示Daclatasvir可使病人體內(nèi)的RNA水平下降約3.5 log10，與干擾素聯(lián)用時對基因型1a的有效率為70%左右[5]。我國CHC患者的標準治療方案是聚乙二醇干擾素-α與利巴韋林的聯(lián)合應用，而美國、歐洲和日本近年來在開發(fā)直接抗病毒藥物(DAAD)上取得了突破，一類新藥CZYS-201402-04(藥品代號)是針對丙型肝炎病毒NS5A靶點的的新型抑制劑。該化合物具有活性高、低毒性、高生物利用度等特點。在該藥物的質(zhì)量標準方面，尚無有關物質(zhì)檢測的方法報導。本文建立了CZYS-201402-04有關物質(zhì)檢查的HPLC方法[6,7]。

1儀器與試藥

Agilent 1260 液相色譜儀，G1314F紫外檢測器，G4212B DAD檢測器，G1316A柱溫箱，OpenLAB CDS EZChrom 色譜工作站。CZYS-201402-04對照品(含量：99.8%)，CZYS-201402-04精制品(批號：201402-04-140405,201402-04-140501，201402-04-140502，常州寅盛藥業(yè)有限公司)；純化水；乙腈、甲醇為色譜級；磷酸、磷酸二氫鉀為國產(chǎn)分析純。

2方法與結果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗采用Zorbax Eclipse Plus C18(4.6 mm×100 mm,3.5 μm)色譜柱，用二元梯度洗脫的方式，流動相A為10 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)pH至3.0)，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序[8]為0 min：A∶B=90∶10，10 min：A∶B=60∶40；25 min：A∶B=50∶50，30 min：A∶B=20∶80，35 min：A∶B=20∶80，后運行時間為5 min。檢測波長為210 nm，柱溫40 ℃，流速1.0 mL·min-1。進樣體積10 μL。系統(tǒng)適用性試驗要求在此色譜條件下分析，主峰的理論塔板數(shù)應不得低于3 000，主峰拖尾因子應不大于2.0，主峰與相鄰峰的分離度應不得低于1.5。

2.2溶液配制及檢測 照《中國藥典》2010年版(二部)高效液相色譜法的要求[9]，取供試品30 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻即得濃度為0.6 mg·mL-1樣品溶液。照選定色譜條件，取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按面積歸一化法計算，即得。色譜圖見圖1。

圖1　空白(A)及供試品溶液(B)的色譜圖

2.3專屬性考察分別制備酸、堿、氧化、高溫、高濕及強光照射破壞的樣品溶液[10]，制成0.6 mg·mL-1的樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別進樣10 μL，記錄色譜圖，試驗結果顯示，在選定的色譜條件下，CZYS-201402-04與降解物質(zhì)均能較好的分離，且主峰峰純度均為0.95以上，沒有雜質(zhì)包夾的現(xiàn)象。6種降解條件下的色譜圖見圖2～7。

圖2　高濕(RH 90%±5%)破壞的色譜圖

圖3　高溫(105 ℃)破壞的色譜圖

圖4　酸(1 mol·L -1乙酸溶液)破壞的色譜圖

圖5　氧化(3%雙氧水溶液)破壞的色譜圖

圖6　光照(4 500 Lx以上)破壞的色譜圖

圖7　堿(1 mol·L -1氫氧化鈉溶液)破壞的色譜圖

2.4定量限(LOQ)、最低檢測限(LOD)的確定分別配制一系列不同濃度的CZYS-201402-04溶液，按照“2.1”項下色譜條件，分別進樣記錄色譜圖。按照信噪比10∶1，測得CZYS-201402-04的定量限為0.039 ng(0.003 9 μg·mL-1)。按照信噪比3∶1，測得CZYS-201402-04的檢測限為0.013 ng(0.001 3 μg·mL-1)。

2.5精密度試驗(重復性和中間精密度)通過兩人在不同時間進行樣品的測定，記錄色譜圖，按面積歸一化法計算純度，檢查進樣精密度(重復性和中間精密度)，試驗結果表明，本品有關物質(zhì)檢查的進樣重復性RSD=1.5%(n=6)，中間精密度RSD=1.4%(n=9)。

2.6溶液穩(wěn)定性取同一溶液進行數(shù)次測定，室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、18、24 h，分別按“2.1”項下色譜條件，分別進樣10 μL，記錄譜圖。試驗結果表明，CZYS-201402-04的主峰面積RSD=0.5%，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7樣品的測定分別精密稱取3批供試品30 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加稀釋液溶解并稀釋至刻度，混勻即得0.6 mg·mL-1的樣品溶液。按“2.1”項下色譜條件，分別進行有關物質(zhì)檢測，3批樣品的總雜質(zhì)分別為1.0%、1.3%、1.1%。

3討論

3.1檢測波長的選擇根據(jù)上述含量和有關物質(zhì)的檢查方法，對樣品進行DAD檢測，由光譜圖可知，主要有關物質(zhì)如原料、中間體、降解產(chǎn)物的最大吸收均在210 nm左右，反應副產(chǎn)物(位于主峰后)的吸收曲線與主峰一致，最大吸收在340 nm左右。為了有效檢測雜質(zhì)，若將檢測波長設置為340 nm，則可能掩蓋有關物質(zhì)的數(shù)量和大小，因此，將檢測波長定位210 nm。所制定的方法簡單準確，靈敏度高。

3.2方法的選擇該產(chǎn)品為創(chuàng)新藥物，在臨床前研究階段尚未對已知雜質(zhì)做非常深入的研究。在產(chǎn)品檢測中來源于原料、中間體和降解產(chǎn)物的有關物質(zhì)含量較少，而主要雜質(zhì)為反應副產(chǎn)物(位于主峰后)，其吸收曲線與主峰相同，因此，選擇面積歸一化法可有效檢測該主要雜質(zhì)的含量。本文建立的方法可為一類新藥CZYS-201402-04的后續(xù)研究提供一定的理論基礎。

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