結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)聯(lián)合ADA在診斷結(jié)核性腹膜炎中的價(jià)值

·論著·

結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)聯(lián)合ADA在診斷結(jié)核性腹膜炎中的價(jià)值

趙鼎英康雪娜馬少華付建珍蘇新元張紅漫

作者單位： 050500河北省靈壽縣醫(yī)院(趙鼎英、馬少華、付建珍、蘇新元)；河北省靈壽縣中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(康雪娜)；河北省胸科醫(yī)院(張紅漫)

【摘要】目的探討結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn) (enzyme-linked immunospot assay in detection of mycobacterium tuberculosis infection，T-SPOT.TB)聯(lián)合腹水腺苷脫氨酶(ADA)測(cè)定在診斷結(jié)核性腹膜炎中的價(jià)值。方法搜集134例住院患者的臨床資料，其中68例為明確診斷的結(jié)核性腹膜炎患者(結(jié)核組)，66例為非結(jié)核性腹膜炎患者(非結(jié)核組)，并對(duì)其臨床資料進(jìn)行回顧性分析，(所有患者住院期間均行T-SPOT.TB試驗(yàn)及腹水ADA測(cè)定)。結(jié)果結(jié)核組68例行T-SPOT.TB試驗(yàn)，62例陽(yáng)性，診斷結(jié)核性腹膜炎的陽(yáng)性率為91.18%，腹水ADA以40 U/L為陽(yáng)性界值，47例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為69.12%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；非結(jié)核組66例行T-SPOT.TB試驗(yàn)，陽(yáng)性8例，陰性58例，診斷結(jié)核性腹膜炎的特異度為87.88%，腹水ADA特異度90.91%，2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；結(jié)核組68例患者中T-SPOT.TB和腹水ADA兩項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性共42例，兩種方法聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)核性腹膜炎的敏感性為61.76%(42/68)，比單獨(dú)T-SPOT.TB試驗(yàn)陽(yáng)性率有所降低，但特異度升高至100%；T-SPOT.TB試驗(yàn)診斷結(jié)核性腹膜炎的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，和腹水ADA比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而陰性預(yù)測(cè)值明顯高于腹水ADA(P<0.01)。結(jié)論T-SPOT.TB試驗(yàn)診斷結(jié)核性腹膜炎有較高的臨床價(jià)值，與腹水ADA聯(lián)合檢測(cè)可提高其診斷的特異度。

【關(guān)鍵詞】T-SPOT.TB試驗(yàn)；結(jié)核性腹膜炎；腹水ADA

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2015.22.029

【中圖分類號(hào)】R 526【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

收稿日期：(2015-06-10)

結(jié)核性腹膜炎與腹部惡性腫瘤及女性卵巢癌，一般都有腹痛、腹脹、腹水及盆腔包塊，而結(jié)核性腹膜炎和惡性腫瘤的治療及預(yù)后截然不同，因此如何鑒別結(jié)核性腹膜炎與惡性腫瘤有著重要的臨床意義。腹水是結(jié)核性腹膜炎及惡性腫瘤常見癥狀，腹水中培養(yǎng)出結(jié)核菌是診斷結(jié)核性腹膜炎的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但陽(yáng)性率非常低，且需要時(shí)間長(zhǎng)；同樣腹水中找到瘤細(xì)胞是確診惡性腫瘤的“金標(biāo)準(zhǔn)”，陽(yáng)性率也不高，需要反復(fù)抽取腹腔積液查找瘤細(xì)胞。近年來(lái)結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)在診斷結(jié)核病中的作用越來(lái)越受到人們的重視，對(duì)診斷結(jié)核性腹膜炎具有較高的敏感性及特異性，本研究對(duì)其在診斷結(jié)核性腹膜炎方面進(jìn)行初步的探討，報(bào)道如下。

1資料與方法

1．1一般資料選取自2013年12月至2014年12月在河北省胸科醫(yī)院、河北省靈壽縣醫(yī)院、靈壽縣中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院住院患者134例，回顧性分析其臨床資料，其中68例為結(jié)核性腹膜炎，男29例，女39例；年齡15～75歲，平均49.5歲。66例為惡性腫瘤(肝臟腫瘤21例，消化道腫瘤30例，卵巢癌15例)，男30例，女36例；年齡20～79歲，平均68.4歲，以上病例均經(jīng)細(xì)胞學(xué)檢查及病理學(xué)檢查確診。

1.2試劑與儀器主要儀器：CO2培養(yǎng)箱，水浴鍋，酶標(biāo)儀。T-SPOT.TB試劑盒(英國(guó)Oxford Immunotec 生產(chǎn))。

1.3方法取靜脈血5 ml，經(jīng)枸櫞酸鈉抗凝，靜脈血經(jīng)分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，制備成濃度為 2.0×106/ml的細(xì)胞懸液。細(xì)胞培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照。植物血凝素作為陽(yáng)性對(duì)照，以結(jié)核分枝桿菌特異性抗原-早期分泌抗原靶蛋白(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白(CFP-10)作為刺激抗原。每孔加入含2.5×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，將微孔板放在含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h；洗板后加入生物素標(biāo)記的二抗，2～8℃反應(yīng)1 h，洗板，加入顯色底物液，常溫避光條件下顯色7 min，去離子水沖洗終止反應(yīng)，在通風(fēng)處干燥培養(yǎng)板2～3 h，顯微鏡下進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。判定標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)空白孔內(nèi)斑點(diǎn)數(shù)<6時(shí)，實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)減去空白孔斑點(diǎn)數(shù)≥6，結(jié)果即為陽(yáng)性；若空白孔斑點(diǎn)數(shù)≥6，實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)≥2倍空白孔斑點(diǎn)數(shù)，結(jié)果即為陽(yáng)性。

1.4標(biāo)本采集及ADA的測(cè)定腹水量多時(shí)，經(jīng)腹腔穿刺獲取，量較少時(shí)從陰道后穹隆穿刺采集。標(biāo)本采集后，3 000 r/min離心15 min，取上清液，按每次用量分裝后，立即置-70℃冰箱凍存待測(cè)。ADA的測(cè)定：ADA試劑盒由北京世珍中拓生物技術(shù)有限公司提供,ADA活性檢測(cè)方法嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，應(yīng)用速率法檢測(cè)，陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：ADA≥40 U/L。

1.5計(jì)算方法T-SPOT.TB試驗(yàn)陽(yáng)性，ADA>40 U/L為診斷結(jié)核性腹膜炎的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算其對(duì)結(jié)核性腹膜炎的敏感度、特異度。敏感度=真陽(yáng)性/(真陽(yáng)性+假陰性)，特異度=真陰性/(真陰性+假陽(yáng)性)。陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性/(真陽(yáng)性+假陽(yáng)性)，陰性預(yù)測(cè)值=真陰性/(真陰性+假陰性)。將T-SPOT.TB試驗(yàn)和ADA檢測(cè)均為陽(yáng)性定義為陽(yáng)性，將其中1項(xiàng)檢測(cè)陽(yáng)性或兩種檢測(cè)均為陰性定義為陰性，計(jì)算T-SPOT.TB和ADA聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)核性胸膜炎的敏感度和特異度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 18.00統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.12組T-SPOT.TB和腹水ADA檢測(cè)結(jié)果結(jié)核組68例患者均行T-SPOT.TB試驗(yàn)，結(jié)果62例陽(yáng)性，診斷結(jié)核性腹膜炎的敏感性為91.18%(62/68)，和腹水ADA 69.12%(47/68)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；非結(jié)核組66例患者全部行T-SPOT.TB試驗(yàn)及腹水ADA檢測(cè)，結(jié)果T-SPOT.TB試驗(yàn)8例陽(yáng)性，58例陰性，特異度為87.88%，腹水ADA檢測(cè)，6例陽(yáng)性，60例陰性，特異度90.91%，2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；結(jié)核組68例患者中有42例T-SPOT.TB試驗(yàn)及腹水ADA均陽(yáng)性，兩者聯(lián)合檢測(cè)診斷結(jié)核性腹膜炎的敏感性61.76%(42/68)；非結(jié)核組66例患者中無(wú)1例T-SPOT.TB試驗(yàn)和腹水ADA均陽(yáng)性，把兩項(xiàng)均為陰性或1項(xiàng)陽(yáng)性定義為陰性，那么兩項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)的特異度為100%，可見，兩項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)，雖然敏感性下降，但特異度上升。見表1。

表1　T-SPOT.TB、腹水ADA檢測(cè)結(jié)果　例

2.2陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值結(jié)核組T-SPOT.TB試驗(yàn)陽(yáng)性62例(真陽(yáng)性)，非結(jié)核組陽(yáng)性8例(假陽(yáng)性)，兩組陽(yáng)性共70例，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為88.57%；結(jié)核組腹水ADA陽(yáng)性47例(真陽(yáng)性)，非結(jié)核組陽(yáng)性6例(假陽(yáng)性)，2組共53例陽(yáng)性，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值88.68%，2組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；非結(jié)核組T-SPOT.TB試驗(yàn)陰性58例(真陰性)，結(jié)核組6例陰性(假陰性)，2組共64例陰性，陰性預(yù)測(cè)值為90.63%，非結(jié)核組腹水DNA陰性60例(真陰性)，結(jié)核組21例陰性(假陰性)，2組共81例陰性，陰性預(yù)測(cè)值70.07%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明T-SPOT.TB試驗(yàn)陰性對(duì)排除結(jié)核性腹膜炎意義更大。見表2。

表2T-SPOT.TB、腹水ADA預(yù)測(cè)值例

類別真陽(yáng)性假陽(yáng)性總數(shù)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(%)真陰性假陰性總數(shù)陰性預(yù)測(cè)值(%)T-SPOT.TB6287088.575866490.63ADA≥40U/L4765388.6860218170.07*

注：與T-SPOT.TB比較，*P<0.01

3討論

結(jié)核性腹膜炎的診斷除依靠患者的臨床癥狀、體征、腹腔積液常規(guī)化驗(yàn)檢查外，最常用的仍為結(jié)核菌素試驗(yàn)(purified protein derivatives，PPD試驗(yàn))，而PPD與卡介苗和非結(jié)核分枝桿菌的抗原易發(fā)生交叉反應(yīng)，在我國(guó)普遍接種卡介苗和非結(jié)核分枝桿菌感染率較高的情況下，PPD結(jié)果假陽(yáng)性率較高，特異度較低；另外，PPD試驗(yàn)受免疫因素影響很大，對(duì)于年老體弱、嬰幼兒、慢性營(yíng)養(yǎng)不良、妊娠期、HIV感染，會(huì)出現(xiàn)假陰性，其靈敏度較低。腹水中培養(yǎng)出結(jié)核菌是診斷結(jié)核性腹膜炎的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但檢出率極低(10%左右)[1]，且需要1～2個(gè)月時(shí)間。病理學(xué)如發(fā)現(xiàn)壞死肉芽組織也可診斷結(jié)核病，但獲取病理組織創(chuàng)傷較大，有時(shí)病理標(biāo)本難以獲取。有研究報(bào)道非選擇性腹膜活檢對(duì)不明原因腹腔積液的確診率僅為6.7%～46.4%[2]。血清結(jié)核抗體對(duì)結(jié)核病診斷價(jià)值，其敏感性及特異性均不高[3]。現(xiàn)有的其他一些檢測(cè)方法對(duì)于結(jié)核性胸膜炎的診斷都存在局限性。目前，很大一部分結(jié)核性腹膜炎患者是根據(jù)其臨床表現(xiàn)、癥狀、體征做出臨床診斷，給予抗結(jié)核試驗(yàn)性治療，但需要2～4個(gè)月時(shí)間。

ADA在人體各器官組織中廣泛分布，在T淋巴細(xì)胞含量最高，結(jié)核是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，結(jié)核性腹水患者血清及腹水中ADA活性均明顯升高。單國(guó)棟等[4]報(bào)道以腹水ADA>18 U/L為陽(yáng)性界值，診斷結(jié)核性腹膜炎的敏感度97.8%，特異度73.3%。周樂(lè)亮等[5]報(bào)道以腹水ADA≥30 U/L為陽(yáng)性界值，敏感度為36.4%，特異性為100%，可見，ADA陽(yáng)性界值越高，診斷結(jié)核的特異性越高，而敏感性越低。近年來(lái)有學(xué)者通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得特性曲線，表明結(jié)核性腹膜炎患者界定值為35 U/L時(shí)，其診斷特異性為92.6%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為87.5%，陰性預(yù)測(cè)值為100%[6]。本研究以腹水ADA>40 U/L為陽(yáng)性界值，其診斷結(jié)核性腹膜炎的敏感度為69.12%，特異度為90.91%。腹水ADA測(cè)定所定陽(yáng)性界值不同、試劑來(lái)源不同、實(shí)驗(yàn)方法不同影響其靈敏度及特異度。

近年來(lái)，在臨床上廣泛應(yīng)用的結(jié)核感染T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)是診斷結(jié)核分枝桿菌感染的新方法，在結(jié)核病診斷方面具有較高的敏感度[7]。其原理是機(jī)體受到結(jié)核桿菌抗原刺激后，其外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞(PBMC)產(chǎn)生結(jié)核特異性T淋巴細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞再次遇到同類抗原時(shí)能產(chǎn)生γ-干擾素。通過(guò)檢測(cè)γ-干擾素濃度或進(jìn)行結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)技術(shù)(T-SPOT.TB)從單細(xì)胞水平檢測(cè)分泌γ-干擾素的細(xì)胞數(shù)目，從而判斷機(jī)體是否感染了結(jié)核桿菌，對(duì)活動(dòng)性結(jié)核分枝桿菌感染具有較高的敏感性[8]。李林陽(yáng)等[9]報(bào)道T-SPOT.TB檢測(cè)診斷肺結(jié)核靈敏度為90.63%，特異度為87.93%。 另有研究顯示，T-SPOT.TB檢測(cè)在潛伏性結(jié)核感染及免疫抑制的結(jié)核病患者均能檢測(cè)[10]。但成金英等[11]報(bào)道的一組結(jié)核病患者中，有3例為粟粒型結(jié)核病患者，其T-SPOT.TB檢測(cè)均為陰性；Cho等[12]報(bào)道，T-SPOT.TB在結(jié)核性腦膜炎或粟粒型結(jié)核等急性結(jié)核菌感染者，其敏感性僅為79%，說(shuō)明T-SPOT.TB可能受機(jī)體免疫力影響。本研究結(jié)核組有6例T-SPOT.TB試驗(yàn)陰性，其中有5例腹水生長(zhǎng)迅速，屬于結(jié)核急性感染期，另外1例合并胸腔積液、心包積液等多漿膜腔積液，出現(xiàn)假陰性可能和患者免疫力低下有關(guān)。

本研究結(jié)核組患者68例均行T-SPOT.TB試驗(yàn)，62例陽(yáng)性，6例陰性，診斷結(jié)核性腹膜炎的敏感性為91.18%，與文獻(xiàn)報(bào)道[5]基本一致，和腹水ADA(69.12%)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，非結(jié)核組66患者行T-SPOT.TB試驗(yàn)，8例出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，58例陰性，特異度87.88%，與腹水ADA(90.91%)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，8例假陽(yáng)性患者可能存在潛伏性結(jié)核菌感染或陳舊性結(jié)核菌感染，需嚴(yán)密隨訪，警惕該部分患者發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病。本研究有42例T-SPOT.TB試驗(yàn)和腹水ADA檢測(cè)均為陽(yáng)性，兩項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)靈敏度為61.76%(42/68)；非結(jié)核組66例患者中無(wú)1例T-SPOT.TB試驗(yàn)和腹水ADA均陽(yáng)性，把兩項(xiàng)均為陰性或1項(xiàng)陽(yáng)性定義為陰性，那么兩項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)的特異度為100%，可見兩項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)，雖然敏感性下降，但特異度上升。另外，本研究T-SPOT.TB試驗(yàn)診斷結(jié)核性腹膜炎陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為88.57%，和腹水ADA (88.68%)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而其陰性預(yù)測(cè)值90.63%，明顯高于腹水ADA 的陰性預(yù)測(cè)值(70.07%)。可見T-SPOT.TB診斷結(jié)核性腹膜炎具有較高的敏感度及陰性預(yù)測(cè)值，結(jié)合腹水ADA檢測(cè)能提高診斷特異度，可有效避免誤診，有更高的臨床診斷價(jià)值。

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