蛋白標志物在荷人卵巢癌裸鼠移植瘤與化療后移植瘤中的表達差異

·論著·

蛋白標志物在荷人卵巢癌裸鼠移植瘤與化療后移植瘤中的表達差異

孫亞楠侯連國賈曉鵬崔娜張彩虹

項目來源：河北省醫學科學研究重點課題(編號：20130005)

作者單位： 050082石家莊市，中國人民解放軍白求恩和平醫院婦產科(孫亞楠、張彩虹)；河北醫科大學生化教研室(侯連國)；河北醫科大學第三醫院(賈曉鵬);河北醫科大學第二醫院(崔娜)

【摘要】目的建立荷人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，給予順鉑(DDP)最大可耐受劑量化療(maximumtolerateddose chemotherapy，MTD-DDP)和順鉑低劑量節拍化療(low-dose metronomic chemotherapy，LDM-DDP)，探討初發移植瘤與不同模式化療后移植瘤中乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistant protein，BCRP)、P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)和腫瘤干細胞標記物ALDH1(aldehyde dehydrogenase 1, ALDH1)表達水平的差異。方法用人卵巢癌SKOV3細胞株建立荷人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，60只裸鼠隨機分為MTD-DDP組、LDM-DDP組和對照組，每組20只。2周成瘤后處死對照組裸鼠，用蛋白質印跡法(Western Blotting, WB)檢測移植瘤組織中BCRP、P-gp和ALDH1的表達水平。MTD-DDP組、LDM-DDP組在化療結束后處理裸鼠，用相同方法檢測化療后移植瘤組織中移植瘤組織中BCRP、P-gp和ALDH1的表達水平，探討造成差異的原因。結果60只裸鼠均成瘤，成瘤率為100%。LDM-DDP和 MTD-DDP組的BCRP蛋白表達水平低于對照組，且LDM-DDP組BCRP表達水平低于MTD-DDP組(P<0.05)。 MTD-DDP組、LDM-DDP組P-gp蛋白表達均高于對照組，且LDM-DDP組P-gp表達水平低于MTD-DDP組(P<0.05)。LDM-DDP和MTD-DDP組的ALDH1表達低于對照組，且LDM-DDP組ALDH1表達水平低于MTD-DDP組(P<0.05)。結論與LDM-DDP組相比較，MTD-DDP組化療后殘余瘤中耐藥相關蛋白高表達，且更易富集腫瘤干細胞標志物ALDH1，LDM是一種未來可供選擇的，目的在于提高化療敏感性、降低復發耐藥的化療模式。

【關鍵詞】卵巢上皮性癌；DDP化療；多藥耐藥相關蛋白；蛋白印跡法

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2015.22.036

【中圖分類號】R 737.31【文獻標識碼】A

收稿日期：(2015-06-15)

卵巢癌是女性癌癥相關死亡的主要原因[1]，卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer，EOC)往往占卵巢癌總發病率的90%，該病通常在晚期發現，迄今為止，沒有高度有效的針對治療策略。傳統的治療通常包括腫瘤細胞減滅術和后續以鉑類藥物為基礎的聯合化療，但近1/2患者在18月內復發[2]，同時因為EOC容易產生化療耐藥，EOC極易復發，使得5年生存率長期徘徊在20%～40%[3]。傳統的最大耐受劑量化療(MTD)往往是通過殺死對化療敏感的絕大部分增殖狀態的卵巢癌細胞，可以有效控制腫瘤,但副反應較重且易產生化療耐藥。因此，就MTD模式，有學者提出低劑量節拍化療(LDM)，LDM模式是一種新的化療模式，化療總劑量需等同于MTD化療模式[4,5]。化療方式通常采用常規化療劑量1/10～1/3，高頻率/脈沖式持續(一般為每天或每3天或每7天)給藥方式，不僅能有效的縮短化療間歇期，增加腫瘤細胞在化療藥物中暴露的時間，還能以新生血管系統的內皮細胞作為靶目標，減輕化療副反應，且很少產生骨髓抑制，從而成為一個有吸引力的和行之有效的抗腫瘤復發的策略[6-8]。本實驗通過建立荷人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，分別給予MTD化療和LDM化療，觀察未給予化療及給予上述兩種化療后移植瘤中相關耐藥蛋白和腫瘤干細胞標記物ALDH1表達差異，探討造成差異可能的機制，為臨床尋找一種新的化療模式提供思路。

1材料與方法

1.1實驗動物本實驗選取雌性BALB/c裸鼠，小鼠6～8周齡，體重18～20 g，購自中國醫學科學院實驗動物研究所，合格證為SCXK(京)2013-004，在SPF級條件下飼養，所有動物實驗操作過程均遵照國際動物委員會制定的倫理道德規范。

1.2細胞株人卵巢癌漿液性乳頭狀囊腺癌細胞株SKOV3由中科院上海細胞庫提供，中高分化，貼壁生長，本實驗室傳代培養，SKOV3細胞接種于含10%胎牛血清(FBS)的McCoy’s-5A液體培養基中，培養瓶置于37℃恒溫，含5%CO2的細胞培養箱中。

1.3實驗試劑McCoy’s-5A培養液購自美國Gibico公司；注射用順鉑購自云南生物谷燈盞花藥業；Anti-BCRP 抗體，Anti-P-gp 抗體，Anti-ALDH1抗體購自美國Millipore 公司。

1.4建立裸鼠皮下移植瘤模型取對數生長期SKOV3細胞1×107個接種于裸鼠右側大腿皮下，建立荷人卵巢癌異種移植瘤模型。將60只裸鼠隨機分為3組，對照組，MTD-DDP組，LDM-DDP組，每組20只。成瘤后處死對照組裸鼠，進行Western-Blot法檢測移植瘤中BCRP、P-gp和ALDH1的表達。無菌條件下取出裸鼠皮下移植瘤，提取組織總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量。取30 μg等量蛋白上樣，10%SDS-PAGE膠用以分離蛋白，20 V恒壓、130 mA條件下轉膜30 min。封閉液封閉蛋白轉移膜1 h。加入一抗BCR抗體、P-gp抗體及ALDH1(1∶500稀釋)，室溫孵育，12 h。第2天洗滌未結合一抗，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶3 000稀釋)，室溫孵育1 h。避光顯色，X線膠片曝光。膠片經URP Imagestore 7500凝膠成像分析系統掃描，分析條帶灰度值。待測蛋白表達量與內參照β-actin表達量進行對比，表示蛋白的相對表達水平。實驗重復3次。

1.5化療總劑量相同，MTD-DDP組：DDP 3 mg/kg，1次/3 d，腹腔注射共6次；LDM-DDP組DDP1 mg/kg，1次/d，腹腔注射共18次。

2結果

2.1成瘤率60只裸鼠皮下異種移植瘤模型2周均能成瘤，成瘤率100%。

2.2蛋白質印跡法檢測結果BCRP蛋白表達：BCRP蛋白表達水平均在MTD-DDP組和LDM-DDP組均高于對照組(P<0.05)；而LDM-DDP組BCRP蛋白表達顯著低于MTD-DDP組(P<0.05)。P-gp蛋白表達：P-gp蛋白表達水平在MTD-DDP組和LDM-DDP組均高于對照組(P<0.05)；而LDM-DDP與MTD-DDP組之間P-gp蛋白表達水平無明顯差異(P>0.05)。ALDH1表達：ALDH1蛋白表達水平在MTD-DDP組和LDM-DDP組均高于對照組(P<0.05)；而LDM-DDP組中ALDH1蛋白表達水平低于MTD-DDP組(P<0.05)。見表1、圖1。

表1　荷人卵巢癌裸鼠模型中，在對照組，MTD組和LDM組中

注：與對照組比較，*P<0.05；與MTD組比較，#P<0.05

圖1荷人卵巢癌裸鼠模型中，在對照組，MTD組和LDM組中BCRP、P-gp和ALDH1蛋白表達水平檢測

3討論

MTD化療模式能有效抑制腫瘤生長，但伴有較重的化療副反應，而臨床上在兩次化療之間常存在間歇期，而在間歇期內，部分腫瘤細胞處于細胞分裂周期的靜止期[9,10]，可以躲避化療及放療的攻擊，高表達耐藥蛋白，相比較成熟細胞，其化療敏感性低，從而迅速增殖[11]。

LDM化療模式通常采用常規化療劑量1/10～1/3，高頻率/脈沖式持續(一般為每天或每3天或每7天)給藥方式，不僅能有效的縮短化療間歇期，增加腫瘤細胞在化療藥物中暴露的時間，還能以新生血管系統的內皮細胞作為靶目標，阻斷內皮祖細胞(Endothelial progenitor cells，CEP)的活化，減輕化療副反應，因為針對內皮細胞，LDM化療模式幾乎不產生骨髓抑制，從而成為一個有吸引力的和行之有效的抗腫瘤復發的策略。

研究人員認為，腫瘤具有異構性，導致腫瘤復發的細胞，在腫瘤中只占據一小部分，負責腫瘤的起始、維持和發生，稱之為腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)。ALDH1是維甲酸信號通路(干細胞分化的關鍵途徑)的中心表達酶類，通常在干細胞中高度表達。ALDH1已經從大量患者樣本和試驗中鑒定和分離出來，也被視作一些列惡性腫瘤的CSC標志蛋白，包括乳腺、結腸、大腦、肝臟、肺和卵巢[12-16]。傳統的MTD模式無法有效的針對這一小部分干性最強的卵巢癌干細胞做出強有力的殺傷，與此相反的是，MTD化療模式更能富集具有干性特征的卵巢癌干細胞。本研究發現，MTD-DDP組ALDH1蛋白表達高于LDM-DDP組和對照組。說明在卵巢癌內部的腫瘤細胞具有層級制度，MTD-DDP模式能大量殺死對化療敏感的腫瘤細胞，對化療不敏感的細胞開始激活，占據主導地位，隨著化療次數增多，不敏感細胞逐漸增多，最終導致化療耐藥，腫瘤復發。

P-gp和BCRP是最常見的多藥耐藥ABC轉運蛋白。P-gp通過與抗腫瘤藥物相結合，依賴ATP水解能量將細胞內的藥物泵出細胞外，從而降低胞內化療藥物的濃度，使得腫瘤耐藥。除此之外，如果正常細胞持續表達P-gp往往被認為是癌變標志。文獻報道，P-gp在腫瘤組織中含量高的患者對化療敏感性差，容易復發和轉移，預后較差[17]。本研究顯示，MTD-DDP組、LDM-DDP組P-gp蛋白表達均高于對照組(P<0.05)，但前二者之間無明顯差異，我們因此推測，P-gp能夠在EOC化療耐藥起到一定的作用，但并非主導作用。BCRP也是多耐藥蛋白，它作用的機制是通過將藥物從細胞中“排出”，進而影響化療藥物的吸收，改變化療藥物的作用和濃度。徐志宏等研究學者提出BCRP的過度表達與腫瘤復發明顯相關[18]，在耐藥方面起很大作用。一旦腫瘤細胞過度表達BCRP，則可呈現對多種化療藥物的抵抗性[19]。本研究顯示，MTD-DDP組、LDM-DDP組P-gp蛋白表達均高于對照組(P<0.05)，且LDM-DDP組BCRP蛋白表達顯著低于MTD-DDP組(P<0.05)，說明LDM模式確實可以降低化療藥物的耐藥性，減少復發。

綜上所述，本研究中，耐藥相關蛋白BCRP、P-gp和腫瘤干細胞標記物ALDH1在經過化療的裸鼠移植瘤內含量明顯高于未經化療的裸鼠，以MTD組最高，說明MTD組能夠在某種程度上富集卵巢癌干細胞，使得對化療敏感度低的細胞富集，而LDM模式能夠降低卵巢癌干細胞比例，持續無間歇給藥能夠阻止CSCs重新形成腫瘤，增強化療敏感性，因此如果能將LDM化療模式成功的應用于卵巢癌臨床化療中，將極大的增強抑瘤效果，減低復發。

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