熱原及其檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

郭春雪

摘要：目的：對(duì)熱原物質(zhì)及其檢測(cè)方法進(jìn)行闡述。方法：通過(guò)對(duì)熱原物質(zhì)本質(zhì)的分析，總結(jié)藥典要求的家兔熱原檢測(cè)法和內(nèi)毒素檢測(cè)法的優(yōu)缺點(diǎn)，并根據(jù)兩種常用檢測(cè)方法使用存在的局限性，簡(jiǎn)要介紹新的熱原檢測(cè)法-細(xì)胞檢測(cè)法。結(jié)果與結(jié)論：家兔法和內(nèi)毒素檢測(cè)法的影響因素限制了檢測(cè)方法的使用范圍，新的檢測(cè)方法拓寬了檢測(cè)范圍，實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，但仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證和論證，故需要進(jìn)一步完善熱原檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)藥品的使用安全。

關(guān)鍵詞：熱原物質(zhì) 熱原檢測(cè)方法 研究

中圖分類(lèi)號(hào)：R286 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2015）02（b）-0000-00

熱原在韋伯斯特字典中曾被定義為致熱劑，是指由微生物進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)時(shí)引起恒溫動(dòng)物體溫異常升高的致熱性物質(zhì)，包括內(nèi)毒素，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞碎片、真菌和病毒等。目前普遍認(rèn)為熱原所引起的發(fā)熱反應(yīng)主要是由革蘭氏陰性細(xì)菌所產(chǎn)生的內(nèi)毒素（脂多糖）引起的，因其存在的普遍性、穩(wěn)定性和相對(duì)的致熱性，內(nèi)毒素的檢測(cè)又可以保護(hù)人和動(dòng)物避免發(fā)生有害反應(yīng)（敗血癥），故FDA和USP指南要求所有非經(jīng)腸道藥品和醫(yī)療器械的終產(chǎn)品都要做內(nèi)毒素檢測(cè)，使產(chǎn)品不因內(nèi)毒素而效力降低[1]，但是嚴(yán)格意義上說(shuō)，不是每一種熱原都具有脂多糖結(jié)構(gòu)，所以，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，熱原的檢測(cè)方法已經(jīng)從動(dòng)物試驗(yàn)、定性試驗(yàn)發(fā)展到定量試驗(yàn)，也已經(jīng)從廣泛應(yīng)用鱟血細(xì)胞檢測(cè)發(fā)展到利用人源細(xì)胞檢測(cè)。

1 熱原的定義

在 15至16世紀(jì)，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)界充滿(mǎn)著關(guān)于靜脈注射療法的諸多報(bào)道，起因于許多病人經(jīng)靜脈注射后都伴隨著發(fā)熱反應(yīng)，直到18世紀(jì)丹麥生物學(xué)家panum的研究中斷定，引起這種發(fā)熱反應(yīng)其實(shí)是一種對(duì)熱穩(wěn)定，溶于水但不溶于乙醇，由活的細(xì)菌中由來(lái)的一類(lèi)物質(zhì)，微量注射后就可引起高熱反應(yīng)，1923年至1925年美國(guó)科學(xué)家Florence Seibert證實(shí)了所有的注射發(fā)熱反應(yīng)都是由可過(guò)濾、熱穩(wěn)定的革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生的物質(zhì)造成的，隨后Rademaker進(jìn)一步證實(shí)了seibert的發(fā)現(xiàn)，并共同確立了使用家兔檢測(cè)注射劑及穩(wěn)定生產(chǎn)靜脈注射液的方法。細(xì)菌內(nèi)毒素革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞外壁層上的特有結(jié)構(gòu)，在生活狀態(tài)時(shí)不釋放出來(lái)，只有當(dāng)細(xì)菌死亡自溶或粘附在其他細(xì)胞時(shí)才表現(xiàn)出毒性，內(nèi)毒素的主要化學(xué)成分是脂多糖，其水溶性好，耐熱性穩(wěn)定，核酸多糖的高分子結(jié)構(gòu)也不易被破壞。在機(jī)體水平上的活性主要表現(xiàn)為發(fā)熱性、致死毒性和血小板減少等。 熱原即發(fā)熱性物質(zhì)，廣義上說(shuō)是所有引起恒溫動(dòng)物體溫異常升高物質(zhì)的總稱(chēng)，除內(nèi)毒素引起發(fā)熱外，其實(shí)還包括病毒，干擾素以及其他種種發(fā)熱物質(zhì)，所以，所有可以引起熱原反應(yīng)的物質(zhì)都是熱原檢測(cè)的范疇

2 熱原的檢測(cè)方法

2.1 家兔熱原檢查

家兔熱原檢查法是1942年首次被收載于《美國(guó)藥典》12版，半個(gè)世紀(jì)以來(lái)也一直作為法定熱原檢查的權(quán)威標(biāo)準(zhǔn)為各國(guó)藥典所采用，該方法是將一定劑量的供試品靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況，以此判定供試品所含熱原的限度是否符合規(guī)定。該方法優(yōu)點(diǎn)是家兔與人類(lèi)所引起的發(fā)熱反應(yīng)的最小內(nèi)素素幾乎相當(dāng)，并且家兔還具有繁殖容易，使用、注射方便等特點(diǎn)，該方法不但能檢測(cè)出細(xì)菌內(nèi)毒素的致熱原，也能檢測(cè)出非細(xì)菌內(nèi)毒的致熱原[2]，并且適用于檢查較多種類(lèi)的熱原物質(zhì)，仍是目前我國(guó)藥品和生物制品質(zhì)量評(píng)價(jià)中常用的方法。同時(shí)該方法也受到多種因素影響檢測(cè)結(jié)果，家兔體溫的穩(wěn)定性和均一性是家兔檢測(cè)熱原的一個(gè)重要的因素，但是由于受到飼養(yǎng)環(huán)境、實(shí)驗(yàn)環(huán)境、家兔個(gè)體差異和種屬差異的影響，家兔的體溫很維持在所需要的范圍內(nèi)，此外，使用活體動(dòng)物費(fèi)用較高，重復(fù)性差，應(yīng)用范圍有限，也不符合3R原則[即減少（reduction）、替代（replace）和優(yōu)化（refinement） [3]，該方法本身又是一種不能定量的限度試驗(yàn)，因此建立一種準(zhǔn)確、規(guī)范的定量檢測(cè)熱原方法勢(shì)在必行。

2.2 細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)法

細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)法（Bacterial Endotoxin Test，BET）是由美國(guó)科學(xué)家Drs.Frederick B.Bang和Jack Levin創(chuàng)建的，于1980年被正式收載于《美國(guó)藥典》20版，也被稱(chēng)作鱟試劑檢測(cè)法，鱟試劑是使用美洲鱟的阿米巴細(xì)胞的溶胞物質(zhì)制備的，因此取名為L(zhǎng)lus Amebocyte Lysate（LAL），BET是基于鱟試劑與內(nèi)毒素發(fā)生特異性反應(yīng)，形成凝膠或顯色來(lái)判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法，是控制藥品質(zhì)量的一項(xiàng)重要檢測(cè)項(xiàng)目，該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，結(jié)果快速可靠，靈敏度較兔法高10倍以上，試驗(yàn)成本低廉，最重要的是可以利用細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品（Endotoxin Standard）對(duì)供試品進(jìn)行定量或半定量檢測(cè)，應(yīng)用范圍廣泛。但是該方法最大的缺點(diǎn)是只能對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行檢測(cè)，此外，由于鱟資源有限，鱟試劑又易受外界條件干擾，如PH值，溫度等，發(fā)生假陽(yáng)性的幾率較高，所以目前還不能完全取代家兔檢測(cè)法。

2.3 細(xì)胞檢測(cè)法

隨著基因治療產(chǎn)品、新生物材料及中藥注射劑等新制品的不斷增加，家兔熱原檢測(cè)法和BET法本身存在的局限性，以及公眾對(duì)動(dòng)物保護(hù)的呼聲日益高漲，因此研究新的熱原檢測(cè)法是一種趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)外源性發(fā)熱物質(zhì)能刺激免疫細(xì)胞分泌一些與發(fā)熱有關(guān)的細(xì)胞因子，通過(guò)酶聯(lián)免疫法對(duì)相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行定量檢測(cè)就能確定外源性熱原的存在與否及存在含量[4]，這是進(jìn)行新方法研究的依據(jù)，根據(jù)細(xì)胞的不同來(lái)源和種類(lèi)可分為三大類(lèi)：人來(lái)源血液或細(xì)胞法、其他動(dòng)物來(lái)源血液或細(xì)胞法、細(xì)胞模型。與傳統(tǒng)方法相比較，新的檢測(cè)方法具有BET高靈敏度和家兔法寬檢測(cè)譜，檢測(cè)費(fèi)用更加低廉，更能反映人體對(duì)不同種熱原的反應(yīng)，填補(bǔ)了傳統(tǒng)方法的空白，更大程度的保證了人體臨床用藥的安全。盡管目前已經(jīng)有7中新檢測(cè)方法得到歐洲權(quán)威機(jī)構(gòu)，英國(guó)國(guó)家生物制品檢定所得正式驗(yàn)證和推薦，但是仍有很多不足之處，如對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用或增值抑制作用的藥物，對(duì)細(xì)胞因子有干擾作用的制品等，因此，新熱原檢測(cè)方法還需要進(jìn)一步的完善。

總之，隨著細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的日益發(fā)展和應(yīng)用，利用細(xì)胞檢測(cè)法對(duì)供試品進(jìn)行熱原檢測(cè)是國(guó)際研究熱原物質(zhì)的必然趨勢(shì)，新檢測(cè)方法的進(jìn)一步論證與家兔法、細(xì)菌內(nèi)毒素法的逐步改善必會(huì)更加完善熱原的檢測(cè)方法，使其更加準(zhǔn)確。

參考文獻(xiàn)

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[4]譚德講，任珺，杜穎，等.熱原和熱原檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].藥物分析雜志，2004，24（6）：653-659