糖尿病大鼠肺臟微循環通透性的變化及其意義

彭麗媛 王海瀾（等）

[摘要] 目的 觀察實驗性糖尿病大鼠肺臟微血管通透性的變化，為臨床提供糖尿病肺病的形態學依據。 方法 雄性SD大鼠共60只，體重（220±20）g，按65 mg/kg的劑量一次性腹腔注射鏈脲菌素（STZ）來制備糖尿病大鼠模型，在成模即刻（0周）、成模后2、4、8、12周時分別隨機抽取12只，通過干濕重法、尾靜脈注入伊文思藍（EB）并心臟灌注后在分光光度計下測肺組織OD值以及熒光顯微鏡下測其熒光量來了解肺臟微血管的通透性。另隨機抽取12只大鼠作為正常組。 結果 ①與正常組比較，0周組、2周組糖尿病大鼠肺組織的干濕重稍有增加，但差異無統計學意義（P > 0.05）。而4周組、8周組和12周組糖尿病大鼠出現了組織干濕重明顯增加，差異有統計學意義（P < 0.05）。②與正常組相比較，0周組、2周組糖尿病大鼠肺組織EB含量稍有增加，但差異無統計學意義（P > 0.05）。從4周開始，糖尿病大鼠出現肺組織EB含量明顯增加，差異有統計學意義（P < 0.05）。③熒光顯微鏡下觀察肺腑組織熒光量可見4、8、12周組大鼠肺臟組織出現較強的紅色熒光。 結論 糖尿病導致大鼠肺臟微血管通透性發生了變化。

[關鍵詞] 糖尿病；糖尿病肺病；微循環障礙；伊文思藍；通透性

[中圖分類號] R587.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）01（c）-0023-04

Changes in microvascular permeability of lung in experimental diabetic rats and its significance

PENG Liyuan1 WANG Hailan1 ZHAI Fanglong1 XIE Zaiming1 WANG Mingjun2

1.Affiliated Shenzhen Longgang Central Hospital of Zunyi Medical College， Guangdong Province， Shenzhen 518116， China； 2.Shenzhen Children's Hospital， Guangdong Province， Shenzhen 518000， China.

[Abstract] Objective To observe the changes of microvascular permeability of lung in experimental diabetic rats， and to offer clinical morphologic data for diabetic pulmonary disease. Methods 60 male SD rats with （220 ±20） g were selected and injected with Streptozotocin （STZ） intraperitoneally at a dose of 65 mg/kg body weight to make experimental DM rat models. Then respectively， 12 of them were randomly selected at 0， 2， 4， 8， 12 weeks to measure their dry weight and wet weight of lung tissues. Also， the OD values were observed through spectrophotometer and the amount of fluorescence by a fluorescence microscope after the rats were injected Evans blue （EB） into tail vein. Another 12 rats were randomly selected as normal group. Results ①The difference of lung tissue wet-dry weight among normal group and 0 week group， 2 weeks group was not statistically significant （P > 0.05）. The lung tissue wet-dry weight in 4 weeks group， 8 weeks group， 12 weeks group were all higher than those in normal group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. ②The difference of lung tissue EB content among normal group and 0 week group， 2 weeks group was not statistically significant （P > 0.05）. The lung tissue EB content in 4 weeks group， 8 weeks group， 12 weeks group were all higher than those in normal group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. ③And expression strong red fluorescence was found in the lung tissue of 4 weeks， 8 weeks， 12 weeks group through the fluorescence microscopy. Conclusion Diabetes leads to the changes of lung microvascular permeability in rats.

[Key words] Diabetes； Diabetic pulmonary disease； Microcirculatory disturbance ； Evans blue； Permeability

糖尿病的患病率日益增加，它可使心血管、腎、視網膜、神經等全身多個組織器官的結構與功能發生變化，由于它的致殘、致死性并發癥，目前已成為全球最關注的健康問題之一。20世紀70年代，Yeh等[1]首次提出肺臟可能是糖尿病的靶器官之一。糖尿病引起肺臟損害的假設在之后的國內外研究中得到了肯定[2-3]，并且也越來越受到人們的重視。然而到目前為止，糖尿病引起肺功能損害的原因仍未完全明確。糖尿病對心血管、腎、視網膜、神經等組織器官損害的基礎病變是糖尿病微血管病變，而肺組織存在著豐富的結締組織和血管系統，因此肺部微血管改變亦是糖尿病肺臟損害的病理基礎，故而設計了本課題，旨在為臨床提供糖尿病肺病的形態學依據，也為臨床上預防和治療糖尿病肺病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物

選用健康雄性SD大鼠，體重200～240 g，平均（220±20）g，共72只，購于廣東省動物實驗中心，大鼠適應性喂養1周，動物房采用晝夜交替，時間為12 h/12 h，保證室內溫度（22±2）℃，嚴格遵照遵義醫學院的實驗室管理制度要求。

1.2 藥品與儀器

鏈脲菌素（STZ）：美國Sigma公司，cas 18883-66-4，由上海寶曼生物公司提供；多聚甲醛、伊文思藍（Evans blue，EB）、甲酰胺均由上海寶曼生物公司提供。血糖儀及試紙、電子天平、平頭針、頭皮針、輸液架、自動脫水機、自動包埋機、離心機、石蠟切片機、恒溫水浴箱、烤箱、722分光光度計、熒光顯微鏡、大鼠固定器。

1.3 方法

1.3.1 實驗性糖尿病大鼠模型的制備

健康雄性SD大鼠適應性喂養1周后，禁食不禁水12 h，以65 mg/kg的劑量經腹腔一次性注入新鮮配制的STZ溶液來制備糖尿病模型。72 h后，采取尾靜脈取血測血糖，血糖>16.7 mmol/L則入選為糖尿病模型。正常組的大鼠則腹腔內注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。成模后大鼠給予自由飲食，不用任何藥物干預。

1.3.2 實驗動物的分組

SD大鼠中隨機選取12只作為正常組，腹腔注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；為防止大鼠造模失敗及實驗過程中死亡而造成的數據缺失，實驗組大鼠的實際數量為67只，將它們全部造模后剔除造模不成功的大鼠，造模成功的大鼠則繼續飼養，在0、2、4、8、12周時間點，分別隨機選取12只作為該組的實驗動物。各個實驗組再隨機分為兩個區組，區組1的大鼠行心臟灌注，取下肺組織稱其干濕重；區組2大鼠則尾靜脈注入伊文思藍，循環1 h后行心臟灌注，再在分光光度計下測肺組織的OD值、制作石蠟切片后在熒光顯微鏡下觀察其熒光量。

1.3.3 干濕重法測肺臟組織的含水量

麻醉成功后，將大鼠仰臥固定于實驗臺上，心臟灌注生理鹽水直至右心房流出液呈無色、肺臟變白、肝臟和腎臟變裸色、可視血管均呈白色為止，再灌注室溫4%多聚甲醛60 mL，直至大鼠身體變硬為止。取下肺組織，稱其濕重。再置于58℃烘箱中烘烤72 h至恒重，稱其干重。按Elliot公式計算每毫克肺組織的含水量：肺組織含水量=（濕重-干重）/濕重×100%，用組織含水量的差異來表示肺微血管通透性的變化。

1.3.4 伊文思藍灌注法測肺組織微血管的通透性

1.3.4.1 肺組織EB含量的測定

1.3.4.1.1 繪制標準曲線 取1mg EB置于EP管中，加甲酰胺至10 mL，混勻后從中取出0.8 mL置于EP管中，再加甲酰胺至10 mL，此作為第1管，此時其濃度為8 μg/mL；從第1管中取5 mL，加入甲酰胺至10 mL，作為第2管，其濃度為4 μg/mL；再從第2管中取5 mL加入甲酰胺至10 mL，作為第3管，濃度為2 μg/mL……照此類推，共9管。將各管液體置于50℃水浴箱48 h后，以甲酰胺作為空白對照溶液，用722 N可見分光光度計在620 nm處測定各管溶液的吸光度（即OD值），從而計算出回歸方程：Y=22.938X-0.1066，（R2 = 0.999）。見圖1。

圖1 EB標準曲線

1.3.4.1.2 EB含量的測量 參照相關文獻方法[4]，大鼠經尾靜脈以1.5 mL/kg的濃度注入3%EB溶液，循環1 h后，麻醉、心臟灌注，取下左肺組織，稱重，置入3 mL甲酰胺溶液中，在50℃恒溫水浴箱中孵育48 h以使肺組織中的伊文思藍充分溶解在甲酰胺中，再以4000 r/min的速度離心20 min。取上清液，722分光光度計下測肺組織的OD值，在標準曲線上計算出每份肺組織的EB濃度。再將它與質量相比，可得每克肺組織的EB量，即：每克肺組織EB量（μg/g）=EB濃度（μg/mL）×3 mL/重量（g）。

1.3.4.2 石蠟熒光

如前所述，參照文獻方法[5]，尾靜脈注入EB循環1 h后，麻醉大鼠，行心臟灌注，取下右肺組織后置于4%多聚甲醛溶液中固定12 h，自動脫水機脫水并自動包埋機包埋后再制成石蠟病理切片（防脫玻片），烤片2.5 h，置梯度酒精脫蠟、水化，直接甘油封片，立即在熒光顯微鏡綠色激發光下觀察EB在肺組織中的分布。相同曝光條件下，拍照記錄。

1.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 17.0對數據進行分析，正態分布計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 糖尿病模型制備的結果