Beagle犬血液標本在不同保存條件和保存時間對血液生化指標檢測的影響

余增才，陳潔君，孫晶晶，郭秋平

(廣州醫藥研究總院有限公司藥物非臨床評價研究中心，廣州　510240)

Beagle犬血液標本在不同保存條件和保存時間對血液生化指標檢測的影響

余增才，陳潔君，孫晶晶，郭秋平

(廣州醫藥研究總院有限公司藥物非臨床評價研究中心，廣州510240)

【摘要】目的探索Beagle犬分離后的血清在不同保存條件和保存時間對血液生化指標檢測的影響，保證長期毒性試驗中檢測結果的可靠性。方法選取Beagle犬6只，雌雄各半，采集Beagle犬靜脈血，制備血清后，分別在1 h內、冰箱(2～8)℃保存2、5、8、12 h、冰盒(2～10)℃中進行運輸保存2、5、8 h、冰箱-20℃保存1、3、5 d對丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素(UREA)、肌酐(CREA)、葡萄糖(GLU)、總膽固醇(TCHO)、總膽紅素(TBIL)肌酸激酶(CK)、γ-谷氨?；D移酶(GGT)、鈣(CA)、乳酸脫氫酶(LDH)、 磷(P)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、鈉(Na+)/鉀(K+)/氯(Cl-)進行檢測。結果(2～8)℃冰箱保存12 h內和(2～10)℃冰盒保存8 h內的血液生化值均無差異；與血清分離后1 h內結果比較， -20℃保存5 d的LDL-C差異有顯著性(P<0.05)且變動百分率為39%， CK、LDH值有逐漸增大的趨勢，但無統計學意義(P>0.05)，LDH的變動百分率達41%。結論根據Beagle犬血液標本在不同保存條件和保存時間對血液生化指標檢測結果的影響的試驗結果，在制備血清后，應該在1 h內進行檢測，如未能在樣本制備后1 h內檢測，應將樣本置于(2～8)℃環境并在12 h內進行檢測，或置于約-20℃環境并在3 d內進行檢測。要對血清標本進行運輸的，應放置于冰盒(2～10℃)中，并在8 h內進行檢測。

【關鍵詞】犬，Beagle；保存條件；保存時間；血液生化指標

Beagle犬為新藥安全性評價的常用動物，血液生化指標為長期毒性試驗的常規檢測指標[1,2]。血液生化指標檢測是通過生物或化學方法檢測血液中的各項指標的變化[3]，從而反映出受檢者的健康情況，但不同的保存條件和保存時間的長短都會直接影響生化指標的檢測結果，所以保證血液標本的保存質量具有十分重要的意義[4]。而制備分離后的待測血樣如果不能及時進行生化測定，必然涉及到保存問題[5]，本實驗通過采取不同保存條件和保存時間進行保存血標本，分別檢測不同保存條件和保存時間后血標本的各項生化指標變化情況，為藥物非臨床評價中心實行多場所管理和外單位或異地送檢血液生化學檢查標本提供參考和數據支持。

1材料和方法[6,7]

1.1實驗動物及飼養條件

1.1.1實驗動物：6～10月齡普通級Beagle犬6只，(6～10)kg，雌雄各半。由廣州醫藥工業研究院實驗動物研究開發中心提供，動物生產許可證號：SCXK(粵)2008-0007。廣東省實驗動物質量監測合格證為：監證字2008A043號。以犬籠號及犬的耳號作雙重編號，犬籠號進行插卡標識。

1.1.2飼養條件：動物由取得實驗動物管理資格認可的人員飼養管理。動物飼養于普通級動物房犬觀察室內，通風及光照良好，溫度為(16～26)℃, 濕度為40%～70%。監測合格證號為監證字號：2008C075，實驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2008-0003。動物采用單籠飼養，飲水為經過濾裝置后的自來水由動物自由攝??；飼料為定量喂食，成犬膨化顆粒飼養由廣州醫藥工業研究院實驗動物研究開發中心提供，營養和衛生符合GB14925-2001的要求。

1.2儀器設備

Sigma 3-18K冷凍臺式離心機(德國Sigma公司)、7020全自動生化分析儀(日本日立公司)、K/Na/Cl﹣分析儀(美國Medica公司)。

1.3試劑

血液生化質控品與ALT、AST、ALP、TP、ALB、UREA、CREA、GLU、TCHO、TBIL、CK、GGT、CA、LDH、P、HDL-C、LDL-C、TG試劑盒由北京利德曼公司生產。K/Na/Cl﹣試劑包由美國Medica公司生產。

1.4方法

選取檢疫合格的普通級Beagle犬6只，雌雄各半，采集Beagle犬靜脈血，加蓋于室溫靜置30 min～1 h,以2 000 r/min相對離心力20℃離心15 min，吸出血清在1 h內檢測1次丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素(UREA)、肌酐(CREA)、葡萄糖(GLU)、總膽固醇(TCHO)、總膽紅素(TBIL)肌酸激酶(CK)、γ-谷氨酰基轉移酶(GGT)、鈣(CA)、乳酸脫氫酶(LDH)、 磷(P)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、鈉(Na+)/鉀(K+)/氯(Cl-)；然后將血清分裝為3份，每份分裝為每個檢測時間1管：第1份放置在冰箱中(2～8)℃冷藏保存，在血清分離后2、5、8、12 h檢測上述指標；第2份放置在冰盒(2～10)℃中保存并進運輸過程，在血清分離后2、5、8 h檢測上述指標；第3份放置在冰箱-20℃冷凍保存，第3份血清在冷凍后1、3、5 d檢測上述指標。

表1　Bengle犬血清在2～8℃保存2、5、8、12 h與血清分離后1 h內結果比較

表2　Bengle犬血清在冰盒(2～10℃)中進行運輸保存2、5、8h與血清分離后1h內結果比較

Tab.3Detection results of the serum samples of Beagle dogs preserved in refrigerator at -20℃ for

冰箱-20℃保存Preservationinrefrigeratorat-20℃指標Items1h內Withinanhour1d1day3d3days5d5daysALT(U/L)36.67±7.9936.50±7.7737.17±8.5937.83±7.49AST(U/L)28.33±5.4327.50±4.8527.67±4.2327.83±4.36ALP(U/L)88.00±18.1988.00±19.2284.00±17.2984.83±16.68TP(g/L)66.25±4.4467.13±5.1266.30±3.5567.40±4.68ALB(g/L)26.65±1.5826.98±1.3226.43±1.6926.43±1.79UREA(mol/L)6.30±0.586.31±0.646.31±0.606.43±0.60CREA(umol/L)79.43±6.3377.18±6.2178.77±4.1680.95±8.47GLU(mmol/L)5.56±0.235.52±0.195.47±0.235.40±0.31TCHO(mmol/L)4.18±0.504.71±1.034.15±0.494.24±0.48TBIL(μmol/L)1.08±0.400.98±0.420.97±0.481.03±0.45CK(U/L)128.67±31.33134.50±34.48132.50±33.97135.33±33.18GGT(U/L)3.17±1.473.33±1.033.67±1.033.33±0.82CA(mmol/L)2.75±0.092.75±0.112.75±0.122.76±0.10LDH(U/L)16.17±1.4717.67±2.8818.17±2.9323.00±7.35變動百分率為41%P(mmol/L)1.71±0.151.72±0.151.73±0.171.75±0.18HDL-C(mmol/L)4.34±0.564.38±0.534.27±0.503.77±0.48LDL-C(mmol/L)0.10±0.020.10±0.020.11±0.020.13±0.03*變動百分率為39%TG(mmol/L)0.48±0.090.49±0.090.50±0.100.52±0.09Na+(mmol/L)148.47±5.56148.10±5.21151.92±7.90148.85±5.59K+(mmol/L)4.50±0.154.51±0.124.58±0.204.47±0.18Cl-(mmol/L)116.82±2.35116.98±2.91120.98±5.28116.25±3.26

注：與1 h檢測結果比較，*(P<0.05)，變動百分率計算公式：(d5- h1)/h1*100%

Note: Compared with 1 hour test results,*(P<0.05)，Percentage change formula: (d5- h1)/h1*100%

2結果

2.1Beagle犬血清在冰箱2～8℃保存2、5、8、12 h與血清分離后1 h內結果比較

結果見表1，差異均無顯著性(P>0.05)。

2.2Beagle犬血清在冰盒(2～10℃)中進行運輸保存2、5、8 h與血清分離后1 h內結果比較

結果見表2，差異均無顯著性(P>0.05)。

2.3Beagle犬血清在冰箱-20℃保存1、3、5 d的結果與血清分離后1h內檢測結果比較

除保存5 d的LDL-C差異有顯著性(P<0.05)外，均差異無顯著性(P>0.05)，CK、LDH值有增大的趨勢，但無統計學意義；而LDH的變動百分率為41%，LDL-C的變動百分率為39%(表3)。

3討論

Beagle犬為新藥安全性評價的常用動物，血液生化指標為長期毒性試驗的常規檢測指標，在藥物非臨床研究工作中對血液生化指標的檢測和分析至關重要，在評價藥物對肝腎功能的影響時是通過各種生化實驗方法監測與肝臟、腎臟功能代謝有關的各項指標，以反映肝腎的功能基本狀況[8]。血液生化檢測能為藥物安全性評價實驗和臨床用藥提供基礎數據，所以在檢測血液生化時，為了得到更加準確可靠的數據，應控制好樣本的檢測時間和樣本保存條件。已有的文獻報道[9]，Beagle犬血清在4℃存放24 h和48 h后的結果顯示各項生化指標與放置前無明顯差異，提示不經凍融，4℃保存相對較短時間(如48 h內)更能反映血液生化的“真值”。

本實驗室通過Beagle犬血液標本在不同保存條件和保存時間對血液生化指標檢測的比對實驗，結果顯示Beagle犬血清在冰箱2～8℃保存2、5、8、12 h與血清分離后1 h內結果比較，差異均無顯著性(P>0.05)，與文獻報道[9]的結果一致。

此外本實驗還進行了Beagle犬血清在冰盒(2～10℃)中進行運輸保存2、5、8h與血清分離后1h內結果比較，運輸過程采用專用空調運輸車，并用水銀溫度計記錄冰盒內溫度，結果差異均無顯著性(P>0.05)，提示在冰盒(2～10℃)環境下進行運輸8 h對血液生化檢測結果無明顯影響。

實驗還進行了Beagle犬血清在冰箱-20℃保存1、3、5 d與血清分離后1h內結果比較，結果冰箱-20℃保存5d的LDL-C有顯著性差異(P<0.05)，其他結果差異均無顯著性(P>0.05)，CK、LDH值有增大的趨勢，但無統計學意義；冰箱-20℃保存5 d的LDH與1h內的數據變動百分率達41%，可能是隨著存放時間增長而出現數據波動大導致其標準差變大，而且LDL-C的變動百分率為39%，也出現較大的波動。所以，建議保存于-20℃環境的Beagle犬血清最好在3d內進行檢測。

綜上所述，根據Beagle犬血液標本在不同保存條件和保存時間對血液生化指標檢測結果的影響的試驗結果，在進行Beagle犬血樣采集后，應及時制備、分離血清并在1 h內進行檢測，如未能在樣本制備后1 h內檢測，應將樣本置于(2～8)℃環境并在12 h內進行檢測，或置于約-20℃環境并在3 d內進行檢測。如要對血清標本進行運輸，應放置于冰盒(2～10)℃中，并在8 h內進行檢測。該試驗研究旨在為藥物非臨床評價中心實行多場所管理[10]和外單位或異地送檢血液標本時提供參考，保證檢測結果的準確性。

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〔修回日期〕2015-07-02

研究報告

Influence of different preservation conditions and times on the

measurement of blood biochemical indicators in Beagle dogs

YU Zeng-cai, CHEN Jie-jun, SUN Jing-jing, GUO Qiu-ping

(Center for Drug Non-clinical Evaluation and Research，Guangzhou General Pharmaceutical

Research Institute Co., Ltd，Guangzhou 510240, China)

【Abstract】ObjectiveBeagle dogs are commonly used animal for drug safety evaluation. As the necessary parameters, blood biochemical indicators are detected in acute or chronic toxicity tests. This study aims at assessing the influence of different preservation conditions and different preservation time on blood biochemical indicators to ensure the reliability of test results of long-term toxicity assessment.MethodsSix Beagle dogs (3 males and 3 females) were used in this study. After collection and preparation of serum samples, biochemical indicators were detected after preservation in refrigerator at 2-8℃ for 1, 2, 5, 8, and 12 hours; after preservation in ice transportation boxes at 2-10℃ for 2, 5, and 8 hours; and after preservation in refrigerator at -20℃ for 1, 3, and 5 days. The biochemical indicators included alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and alkaline phosphatase (ALP), total protein (TP), albumin (propagated), urea, creatinine (CREA), glucose (GLU), total cholesterol (TCHO), total bilirubin (TBIL), creatine kinase (CK), gamma pancreatic acyl transferase (GGT), calcium (CA), lactate dehydrogenase (LDH), phosphorus (P), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), triglyceride (TG), sodium (Na+), potassium (K+) and chloride (Cl-). ResultsCompared with the results of samples preserved for 1 hour, the LDL-C result of that preserved in refrigerator at -20℃ for 5 days was significantly increased (P<0.05), and the coefficient of variation was 39%. The CK and LDH results of specimens preserved in refrigerator at -20℃ for 5 days was increased but not significantly (P>0.05), and the coefficient of variation of LDH was 41%. ConclusionsAccording to the test results of blood biochemical indicators in the Beagle dogs detected after different preservation conditions and different preservation time in this study, detection test should be done within 1 hour, if not, detection should be done within 12 hours for the samples preserved at 2～8℃, or within 3 days for the sample preserved at -20℃. For transportation of serum samples, the serum samples should be placed in the ice box at 2～10℃, and detection test should be done within 8 hours.

【Key words】Beagle dogs; Preservation conditions; Preservation time; Blood biochemical indicators

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.008.004

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 08-0018-05

[通訊作者]郭秋平(1978-)，女，高級工程師，博士，從事新藥研發。13427595023@163.com。

[作者簡介]余增才(1985-)，男，助理工程師，本科，從事臨床醫學檢驗。yzc6409634@163.com。

[基金項目]廣州市科信局生物產業重大專項(編號：201300000052)；廣州市海珠區科技計劃項目(編號：2012-CG-01)。