高糖高脂飲食誘導(dǎo)大鼠代謝綜合征模型并發(fā)阿爾茨海默樣變

牛　利，韓德五，許瑞齡，周　鑫，屈重霄

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，太原　030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)肝病研究所，太原　030001；

3.山西省人民醫(yī)院病理科，太原　030012)

高糖高脂飲食誘導(dǎo)大鼠代謝綜合征模型并發(fā)阿爾茨海默樣變

牛利1,2，韓德五2，許瑞齡1,2，周鑫1,2，屈重霄3

(1. 山西醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，太原030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)肝病研究所，太原030001；

3.山西省人民醫(yī)院病理科，太原030012)

【摘要】目的通過(guò)長(zhǎng)期高糖高脂飲食導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)代謝綜合征合并阿爾茨海默(AD)樣改變動(dòng)物模型的研究。方法將48只SD大鼠隨機(jī)分為2組，正常對(duì)照組(用普通飼料飼喂) 24只，高糖高脂組( 飼以高糖高脂飼料)24只，連續(xù)喂養(yǎng)12 個(gè)月。于實(shí)驗(yàn)第 6、9、12月末觀察動(dòng)物體重、腎周和附睪或子宮周圍脂肪重量并計(jì)算Lee指數(shù); 檢測(cè)血液中代謝綜合征相關(guān)生化指標(biāo)的變化；Western blotting測(cè)定海馬Tau蛋白含量及其磷酸化水平；ELISA法檢測(cè)海馬Aβ的含量；HE染色觀察腦組織病理改變。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，各階段高糖高脂組大鼠體重、內(nèi)臟脂肪重量明顯增加; 血清中FPG、TG、LDL等明顯升高，HDL顯著下降；海馬Aβ、P-tau較對(duì)照組明顯升高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;病理組織學(xué)顯示模型組腦組織有明顯的炎性浸潤(rùn)、小膠質(zhì)細(xì)胞活化明顯。結(jié)論高糖高脂飲食誘導(dǎo)大鼠代謝綜合征動(dòng)物模型可并發(fā)AD樣變，可為老年癡呆動(dòng)物模型的構(gòu)建提供一個(gè)新的思路。

【關(guān)鍵詞】阿爾茨海默病;代謝綜合征;炎癥;胰島素抵抗;高糖高脂

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性退行性疾病，本病起病緩慢隱匿，病程呈進(jìn)行性，病因迄今未明。AD患者最典型的臨床表現(xiàn)是學(xué)習(xí)，記憶和認(rèn)知功能的進(jìn)行性減退，其海馬組織中tau蛋白過(guò)度磷酸化和Aβ聚集形成SP，被認(rèn)為是AD特征性病理改變[1]。AD 中，5%的病例為家族性AD(FAD)，95%的病例為散發(fā)性AD(SAD)[2]。SAD 是一種與年齡密切相關(guān)的疾病，是遺傳與環(huán)境相互作用的結(jié)果，但其確切原因和發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。對(duì)于AD的研究目前大多采用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，但其無(wú)法模擬人類緩慢發(fā)病的進(jìn)程，因此有著的局一定的限性。

代謝綜合征(MS)是以胰島素抵抗為核心的各種代謝疾病的總稱，是糖代謝異常、2型糖尿病、高血壓、脂代謝紊亂、腹型肥胖，高胰島素血癥等多種代謝異常集簇發(fā)生在某一個(gè)體的異常病理生理現(xiàn)象。大量的研究表明，與代謝綜合征相關(guān)的糖尿病、高血壓、肥胖等往往是AD潛在的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3,4],故代謝紊亂可能是AD發(fā)病的始動(dòng)因子[5]。本課題組采用高糖高脂膳食喂養(yǎng)大鼠一年，成功復(fù)制出肥胖、非酒精性脂肪性肝病、二型糖尿病、代謝性心肌病等代謝綜合征相關(guān)疾病的動(dòng)物模型[6]。本實(shí)驗(yàn)在此工作基礎(chǔ)上，對(duì)高糖高脂誘導(dǎo)的代謝綜合征大鼠模型的腦組織的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)試和分析，力求尋找AD與代謝綜合征的早期聯(lián)系。

1材料和方法

1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Sprague-Dawley 大鼠48只，雌雄各半，山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證：SCXK(晉) 2009-0001，動(dòng)物使用許可證：SYXK(晉)2009-0004。

1.2主要試劑和儀器

甘油三酯( triglyceride，TG) 試劑盒、低密度脂蛋白(LDL)試劑盒、高密度脂蛋白(HDL)試劑盒等購(gòu)自中生北控公司；AβELISA試劑盒購(gòu)自R&D；Tau、P-tau抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；721 分光光度計(jì)購(gòu)自上海第三分析儀器廠; SN-684 型放免 γ 計(jì)數(shù)器購(gòu)自上海核所日環(huán)光電儀器有限公司。

1.3動(dòng)物分組及模型的建立

48只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周后，隨機(jī)分為 6 組: 6 月、9月、12月正常對(duì)照組，每組8只，以正常飲食喂養(yǎng); 6月、9月、12月高糖高脂組，每組8只，采用高糖高脂膳食( 70% 正常飼料 + 20% 豬油 + 10% 蔗糖 +1% 膽 固 醇 + 0. 25% 膽 酸 ) 喂 養(yǎng)。正常組總熱量13. 89 KJ / g，模型組總熱量 68. 40 KJ / g。以上動(dòng)物均于天黑前投食，自由飲水，每月末稱體重1次。分別于實(shí)驗(yàn)第 6月末、9 月末、12月末取相應(yīng)階段的正常組及高糖高脂組大鼠，腹主動(dòng)脈采血，3 500 r/min 離心備用; 斷頭處死，取腦組織一半于10% 中性甲醛固定液中固定，石蠟包埋切片。另一半凍存于-70℃冰箱待用。

1.4生化指標(biāo)檢測(cè)

嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)( HOMA-IR) :HOMA-IR=( FPG×FINS) /22. 5。

1. 5病理學(xué)檢查

10%中性甲醛溶液固定腦組織進(jìn)行 HE 染色，光鏡下觀察腦組織病理學(xué)改變。

1. 6蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)海馬內(nèi)Tau、P-tau蛋白的水平

取凍存的海馬組織分別置于玻璃勻漿器內(nèi),加入蛋白裂解液在冰浴中反復(fù)研磨，裂解30 min, 于4℃離心機(jī)內(nèi)12 000 r/min離心10 min,取上清液即為蛋白，取10 μL用Bradford法檢測(cè)蛋白濃度,其余儲(chǔ)存于-80℃?zhèn)溆茫{(diào)整各上樣量40 μLwell，用前加2×樣本緩沖液并混勻,于100℃變性5 min, 10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳, 4℃ PVDF轉(zhuǎn)膜過(guò)夜，搖床上5%脫脂奶粉室溫封閉2 h;分別與目的抗體4℃雜交過(guò)夜；PBST洗膜3次,每次10 min;雜交2抗(辣根酶標(biāo)記的羊抗兔),室溫?fù)u床上孵育2 h；PBST洗膜3次,每次10 min; 加入發(fā)光液、曝光、顯影，采用Quantity One (Bio-Rad Laboratories)對(duì)膠片進(jìn)行灰度分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1大鼠體重及內(nèi)臟脂肪重量的變化

2.2代謝綜合征相關(guān)指標(biāo)的變化

模型組大鼠TG、LDL、FPG、HOMA-IR 等都明顯升高(P<0.05)，HDL則明顯降低。說(shuō)明經(jīng)過(guò)高糖高脂喂養(yǎng)后，動(dòng)物出現(xiàn)了糖代謝異常，高甘油三酯血癥，異常脂蛋白血癥及胰島素抵抗等一系列代謝綜合癥相關(guān)特征(表1)。

2.3 tau蛋白與Aβ的表達(dá)

圖2 結(jié)果表明，模型組動(dòng)物P-tau(s199)在6月就明顯升高，9月達(dá)到最高值，且持續(xù)到12月仍較正常組明顯升高；而P- tau(s396)在9月明顯升高且達(dá)到最高值，一直持續(xù)到12月。模型組動(dòng)物Aβ的表達(dá)在6,9,12月均明顯高于正常組，其差異具有顯著性。

2.4腦組織皮層病理學(xué)觀察

圖3(見(jiàn)文后彩插1)結(jié)果表明，正常組動(dòng)物腦組織結(jié)構(gòu)正常，模型組動(dòng)物6月開(kāi)始出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，到12月時(shí)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)最為嚴(yán)重。

3討論

AD是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性退行性疾病，起病徐緩，病程呈進(jìn)行性，病因迄今未明。由于人均壽命延長(zhǎng)，老年人口迅速增長(zhǎng)，AD患病人數(shù)必然相應(yīng)增加，已成為許多國(guó)家的主要保健和社會(huì)問(wèn)題之一。Yaffe等[7]對(duì)2 632名患者追蹤調(diào)查結(jié)果表明，MS是認(rèn)知功能下降的高危險(xiǎn)因素。因此本實(shí)驗(yàn)在高糖高脂誘發(fā)代謝綜合征模型基礎(chǔ)上對(duì)動(dòng)物腦組織進(jìn)行了相關(guān)的研究，以求進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)AD與MS在早期的聯(lián)系。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組動(dòng)物在出現(xiàn)代謝指標(biāo)變化的同時(shí)會(huì)出現(xiàn)AD相關(guān)的特征性病理改變。且HE染色顯示，模型組動(dòng)物腦組織有大量炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，隨著時(shí)間的推遲，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸增多。目前認(rèn)為，炎癥是引起Aβ沉積的繼發(fā)性反應(yīng)，也是導(dǎo)致神經(jīng)元退行性變的重要因素。外周炎癥因子通過(guò)活化腦血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入腦內(nèi)，可引起中樞炎癥反應(yīng)，進(jìn)而影響認(rèn)知功能[8]，同時(shí)炎癥因子激活腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞，活化后的小膠質(zhì)細(xì)胞又可分泌更多的炎癥因子，從而形成惡性循環(huán)，使腦內(nèi)炎癥放大。McDonald等[9]研究表明 激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可產(chǎn)生大量的APP，成為更多 Aβ 的來(lái)源。Tamagno 等[10]的研究亦提示 Aβ 所致氧化應(yīng)激生成的過(guò)氧化產(chǎn)物能夠上調(diào) β 分泌酶的表達(dá)，從而加快 APP 的異常剪切，產(chǎn)生更多的 Aβ。腦內(nèi)炎癥不僅促進(jìn)腦內(nèi)淀粉樣蛋白 Aβ的聚集，還可使tau蛋白的過(guò)度磷酸化，從而促進(jìn)AD發(fā)生。

注：NC:正常組動(dòng)物；HSHF：高糖高脂組動(dòng)物；VF: 內(nèi)臟脂肪重量; BW: 體重。圖1　體重、內(nèi)臟脂肪、Lees指數(shù)的變化 Note.NC: Normal control group; HSHF: Model groups established by high-sugar high-fat diet. VF: Visceral fat weight; BW: Body weight.Fig.1　Changes of body weight, visceral fat, and Lee’s index in the rats.

甘油三酯(TGmmol/L)高密度脂蛋白(HDLmmol/L)低密度脂蛋白(LDLmmol/L)血糖(FPGmmol/L)胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)對(duì)照組(Control)0.080±0.0291.784±0.14120.622±0.1135.099±0.6291.685±0.1776月模型組(6M)0.556±0.151**0.501±0.112**2.878±0.337*11.709±0.471*3.604±0.202*9月模型組(9M)0.570±0.176**0.477±0.179**3.440±0.127**13.784±0.141**3.570±0.184**12月模型組(12M)0.562±0.143**0.434±0.125**3.447±0.099**14.657±0.171**3.390±0.227**

注：與對(duì)照組比較*P<0.05,**P<0.001。Note：compared with the control*P<0.05,**P<0.001.

注：N：正常組動(dòng)物；6M：6月高糖高脂組；9M：9月高糖高脂組；12M：12月高糖高脂組；*P<0.05與正常組比較；# P<0.05與6月高糖高脂組比較。圖2　腦組織Tau蛋白與Aβ含量Note: N: Control group; 6M: High-sugar high-fat diet for 6 months; 9M: High-sugar high-fat diet for 9 months; 12M: High-sugar high-fat diet for 12 months. *P<0.05, compared with the control group; # P<0.05, compared with the 6M group.Fig.2　Expressions of Tau proteins and Aβ in the brain tissue

中樞性胰島素抵抗也是大家公認(rèn)的SAD發(fā)病機(jī)制之一。胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛存在，其通路異常可影響腦內(nèi)葡萄糖的代謝水平，而葡萄糖是腦內(nèi)供應(yīng)能量的主要物質(zhì)。IR的產(chǎn)生不僅會(huì)影響腦組織的能量利用，同時(shí)也擾亂了大腦神經(jīng)中樞信號(hào)的傳遞，因而導(dǎo)致患者認(rèn)知功能障礙的發(fā)生。多項(xiàng)研究表明，胰島素抵抗與認(rèn)知功能下降或AD的危險(xiǎn)性具有明顯的相關(guān)性[11]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)長(zhǎng)期高糖高脂飼養(yǎng)動(dòng)物，出現(xiàn)了一系列代謝綜合征相關(guān)疾病的動(dòng)物模型，其基本特征除炎癥外均存在胰島素抵抗。外周炎癥可參與并促進(jìn)IR的發(fā)生，我們推測(cè)中樞的炎癥同樣也可促進(jìn)中樞IR的發(fā)生;而且高糖高脂喂養(yǎng)大鼠模型在早期就已出現(xiàn)了肥胖[12]，導(dǎo)致體重和內(nèi)臟脂肪含量明顯增加，脂肪細(xì)胞發(fā)生分化異常，引起游離脂肪酸(FFA)水平增加并導(dǎo)致異位沉積。FFA增加與胰島素抵抗的發(fā)生密切相關(guān)，可以影響胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制外周組織及中樞對(duì)葡萄糖的攝取，使葡萄糖氧化和非氧化利用發(fā)生障礙。因此，高脂飲食可通過(guò)影響胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路導(dǎo)致外周 IR，其胰島素受體數(shù)目、PI-3K,PKB 及 GLUT4 水平在高脂飲食后均有所改變。腦內(nèi)的IR 不會(huì)因高濃度的胰島素水平，而下調(diào)其在細(xì)胞膜上的表達(dá)，但其與胰島素的結(jié)合受饑餓、肥胖、老化和地塞米松治療的影響。本實(shí)驗(yàn)后續(xù)結(jié)果顯示，高糖高脂飲食同樣可以通過(guò)影響胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路使中樞發(fā)生IR, PI-3K, PKB, 及GLUT3水平均會(huì)發(fā)生改變。

綜上所述，動(dòng)物在高糖高脂飲食喂養(yǎng)下，除可發(fā)生代謝綜合癥相關(guān)疾病，還可導(dǎo)致AD樣改變，可作為研究早期老年癡呆較為貼合人類實(shí)際的動(dòng)物模型。

參考文獻(xiàn)：

[1]Rasgon N, Jarvik L. Insulin resistance, affective disorders, and Alzheimer’s disease: review and hypothesis [J]. J Gerontol A Biol Sci Med Sci, 2004, 59(2):178-83; discussion 84-92.

[2]李焱. 中樞胰島素抵抗與阿爾茨海默病發(fā)病關(guān)系的認(rèn)識(shí) [J].診斷學(xué)理論與實(shí)踐, 2009, 8(3): 248-251.

[3]Vanhanen, M, Koivisto, K, Moilanen, L, et al. Association of metabolic syndrome with Alzheimer disease: a population-based study [J]. Neurology, 2006, 67: 843-847.

[4]吳惠文, 韓德五, 許瑞齡, 等. 甘氨酸對(duì)高果糖飲食誘導(dǎo)的大鼠胰島素抵抗認(rèn)知功能損害的影響 [J]. Chin J Pathophysiol, 2012, 28(2): 302-307.

[5]Steen E, Terry BM, Rivera EJ, et al. Impaired insulin and insulin-like growth factor expression and signaling mechanisms in Alzheimer′s disease — is this type 3 diabetes？[J]. J Alzheimers Dis, 2005, 7: 63-80.

[6]周鑫, 韓德五, 李素紅, 等. 高糖高脂致大鼠非酒精性脂肪肝合并高血糖動(dòng)物模型的研究[J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 21(7) : 22-27.

[7]Yaffe K, Blackwell T, Kanaya AM, et al．Diabetes, impaired fasting glucose, and development of cognitive impairment in older women [J]. Neurology, 2004, 63(4): 658-663.

[8]Konsman JP, Parnet P, Dantzer R. Cytokine-induced sickness behaviour: mechanisms and implications [J]. Trends Neurosci. 2002, 25(3): 154-159.

[9]McDonald DR, Brunden KR, and Landreth GE. Amyloid fibrils activate tyrosine kinase-dependent signaling and superoxide production in microglia [J]. J Neurosci, 1997. 17: 2284-2294.

[10]Tamagno E, Parola M, Bardini P, et al. Beta-site APP cleaving enzyme up-regulation induced by 4-hydroxynonenal is mediated by stress-activated protein kinases pathways [J]. J Neurochem, 2005. 92(3): 628-636.

[11]石森. 2型糖尿病與阿爾茨海默病相關(guān)性探討 [J].繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育, 2012, 26(11): 36-39.

[12]周鑫, 韓德五, 許瑞齡, 等. 腸源性內(nèi)毒素血癥在代謝綜合征相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2012, 28(3): 492-498.

〔修回日期〕2015-06-17

研究報(bào)告

Alzheimer’s disease-like lesions may occur in and accompany the

high-sugar high-fat diet-induced rat models of metabolic syndrome

NIU Li1，2, HAN De-wu2, XU Rui-ling1,2, ZHOU Xin1，2, QU Chong-xiao3

(1. Department of Pathophysiology, 2. Institute of Liver Disease, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China;

3. Department of Pathology, People’s Hospital of Shanxi Province, Taiyuan 030012

【Abstract】ObjectivesTo explore the relativity between Alzheimer’s disease (AD)-like lesions and metabolic syndrome models induced by high-sugar high-fat diet in rats. Methods Forty-eight Sprague Dawley rats were randomly divided into 2 groups．The control group (fed with normal diet, 12 rats) and high sugar and high fat group (fed with high-sucrose and high-fat diet, 12 rats) continuously for 12 months. At the end of 6, 9 and 12 months of the experiment, we observed the animal body weight and visceral fat weight. The blood lipid levels, blood glucose and MS-related biochemical parameters were determined. The brain tissues were examined by histopathology. The characteristic AD molecules hippocampus Aβ and Tau were detected using ELISA and Western blotting to confirm the presence of AD lesions in the brain. ResultsCompared with the normal control group, the body weight and visceral fat weight of the rats in the high-sugar high-fat groups were significantly increased; the levels of TG, FPG, LDL, HOMA-IR and hippocampus Aβ, phosphorylated Tau (p-Tau) were higher, but the level of HDL was decreased (P<0.05 for all)．The histopathological examination revealed inflammatory cell infiltration in the brain tissues. ConclusionsCharacteristic AD-like lesions may occur and accompany the rat models of metabolic syndrome, induced by high-sugar high-fat diet, and provide a new idea for the construction of Alzheimer’s disease animal models.

【Key words】Metabolic syndrome; Alzheimer’s disease, sporadic; Inflammation; Insulin resistance; High-sugar high-fat diet; Rats

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.008.006

【中圖分類號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2015) 08-0027-04

[通訊作者]韓德五(1934-)，男，教授，研究方向：腸源性內(nèi)毒素血癥與代謝綜合征。Email: 535574141@qq.com。

[作者簡(jiǎn)介]牛利(1976-)，女，講師，研究方向：代謝綜合征與老年癡呆。E-mail: nltys2004@163.com。

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)青年基金(No. 81302220)；山西省自然科學(xué)青年基金(編號(hào)：2014021040-3)。