SD大鼠與C57小鼠5/6腎切除慢性腎功能衰竭模型的比較

余柯娜，麻志恒，鐘利平，何立群

(上海中醫藥大學附屬曙光醫院腎病科，上海　200021)

SD大鼠與C57小鼠5/6腎切除慢性腎功能衰竭模型的比較

余柯娜，麻志恒，鐘利平，何立群

(上海中醫藥大學附屬曙光醫院腎病科，上海200021)

【摘要】目的比較SD大鼠、C57小鼠建立5/6腎切除(5/6 nephrectomy, 5/6NX)慢性腎功能衰竭動物模型的異同，選擇合適的實驗動物以供慢性腎功能衰竭的防治研究。方法將60只SD大鼠和60只C57小鼠分別隨機、平均分成5/6腎切除組和假手術組，分別于術后4周、8周、12周三個時間點處死各組老鼠，收集血清和腎組織供腎功能、α-SMA檢測分析。 結果大、小鼠模型組成活率不存在差異(P>0.05)，大鼠5/6NX組血清肌酐及尿素氮值于8~12周出現穩定狀態，異于小鼠5/6NX組。結論C57小鼠5/6腎切除慢性腎衰模型建立成功。5/6NX大、小鼠組均于術后出現進行性腎功能減退的表現，然其疾病進程不盡相同，臨床應根據監測周期長短選擇合適的實驗動物以準確地反應疾病狀態。

【關鍵詞】慢性腎功能衰竭；5/6腎切除；大鼠；小鼠；模型，動物

慢性腎功能衰竭(chronic renal failure, CRF)是指各種原發性或繼發性慢性腎臟病(CKD)患者進行性腎功能損害所出現的一系列癥狀或代謝紊亂的臨床綜合癥，而終末期腎臟病(ESRD)是其最終結局。近來，Alberto Ortiz等[1]報道,人類慢性腎衰發生風險在40歲時為2%。腎纖維化作為CKD發展至ESRD的最后共同途徑和主要病理基礎，對其發生機制的探討及各種延緩和阻斷其發展手段的探究將是CRF防治中的一個重要課題。于此，首先應尋找與人類CRF相關的動物模型，尤其要找尋既有能體現腎功能進行性減退又符合腎纖維化病理生理特點的動物模型。目前，國內外對大鼠5/6腎切除(5/6 nephrectomy，5/6NX)的研究已經較為完備，且被廣泛應用于心血管和腎臟疾病的基礎和臨床研究中，而國內對5/6NX小鼠動物模型的基礎研究較少。本研究通過建立大、小鼠5/6腎切除慢性腎功能衰竭的動物模型，比較兩種實驗動物模型在成活率、腎小球濾過率、腎小管間質纖維化方面的異同，為提供更能反映慢性腎功能衰竭疾病特點的動物模型建立依據。

1材料和方法

1.1實驗動物及實驗環境

實驗動物: 選用8周齡的雄性野生型C57小鼠60只，體重(20±2)g，10周齡的雄性SD大鼠60只，體重(200±15)g,由上海斯萊克實驗有限公司提供，SCXK(滬)2013-0016。實驗小鼠分籠飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心SYXK(滬)2009-0069，溫度25℃、12 h光照、45% 濕度的環境中，自由飲水，進食標準普通飼料，封閉管理。

1.2儀器與試劑

24 h尿蛋白定量試劑盒，尿素氮測定試劑盒，肌酐測定試劑盒，Masson染色試劑盒均購于南京建成生物公司。兔抗鼠α-SMA抗體，由Abcam公司提供，二抗為山羊抗兔，有上海威奧生物有限公司提供。

1.3動物實驗

1.3.1動物分組：60只8周齡的雄性C57小鼠，體重(20±2)g，適應性喂養1周后隨機分成兩組，假手術組(SOR)30只，5/6腎切除組(5/6NX)30只。60只10周齡的雄性SD大鼠，體重(200±15)g,適應性喂養1周后隨機分成兩組，假手術組(SOR)30只，5/6腎切除組(5/6NX)30只。后每隔2周測量1次體重。

1.3.2動物模型的建立：適應性喂養1周后，用Platt法[2]制作5/6腎切除慢性腎衰腎纖維化模型。于手術臺上放置成人尿墊，將模型組SD大鼠、C57小鼠用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后置于手術臺上。于左肋下1 cm處行一斜向外下方切口(小鼠：0.8～1 cm，大鼠：1～1.5 cm)，切口約與鼠體長縱軸向內成45°角，暴露左側腎臟，分離腎周圍脂肪并剝離腎外包膜后切除腎上下極組織各1/3，用明膠海綿壓迫止血10 min后復位腎臟并縫合。1周后行2期手術，同樣手法麻醉，切開右背暴露右腎，結扎腎蒂后切除整個右腎。故兩次手術共切除約70%腎臟。兩次手術中，假手術對照組的組大、小鼠僅僅暴露雙側腎臟并分離腎周脂肪、包膜后縫合。

1.3.3取材:二期手術2周后對C57小鼠和SD大鼠分別進行眼眶后靜脈叢采血，將血液離心后收集血清。于二期手術后4周、8周、12周分別隨機抽取一定數量大、小鼠進行處死，處死前1 d，將所有大小鼠置于代謝籠中(禁食、不禁水)，收集24 h尿液。處死后，留取血和腎組織備檢。尿樣：留取后迅速送至實驗室進行檢測。血樣：隨機抽取一定數量C57小鼠進行摘眼球取血；隨機抽取一定數量SD大鼠用同樣方法麻醉后腹主動脈采血，將血液以2 000 轉/min離心10 min，分離血清進行檢測。腎組織：留取模型組左殘腎和對照組腎組織。取左腎組織稱重，將腎組織置于4%多聚甲醛溶液中固定并逐級進行脫水、石蠟包埋、切片，進行免疫組織化學染色。

1.3.4檢測方法:

1.3.4.1腎功能、24 h尿蛋白定量檢測:根據試劑盒說明測定24h尿蛋白定量、血清肌酐(Scr)、血清尿素氮(BUN)。

1.3.4.2α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達:組織經4%多聚甲醛溶液固定、脫水、包埋后，切成3 μm厚石蠟切片，按試劑盒說明進行免疫組織化學染色。

2結果

2.1形態和外觀

假手術組：SD大鼠、C57小鼠體毛發生長狀態良好，術后未見明顯毛發脫落、毛色變化、新生絨毛再生等情況。

5/6NX組：C57小鼠于術后3周左右出現毛發脫落現象，脫落部位多在背部，皮膚色白，后毛發脫落面積逐漸增大，六周左右毛發脫落部位開始出現新生絨毛，新生絨毛較短，毛色無光澤。SD大鼠于術后4周左右出現毛發稀疏、脫落等現象，脫落部位多在背部，皮膚色紅，毛發脫落面積較小，8周左右出現新生絨毛，絨毛質軟，多而整齊，與原毛發交織生長。

2.2活動情況

假手術組：術前與術后SD大鼠、C57小鼠的活動量無明顯變化。5/6NX組：術后2周內，SD大鼠和C57小鼠活動力減弱，蜷居于飼養籠角落，出現體態微顫，緊挨取暖等現象，術后6周左右C57小鼠活動量增強，極度活躍、反應敏捷、上躥下跳、活動輕健。術后5周左右，SD大鼠活動力增強，體態微顫、緊挨取暖等現象基本消失。

2.3造模成活率

術后蘇醒，大、小鼠正常進食、進水。造模第2天，小鼠模型組死亡4只，大鼠模型組死亡2只。大、小鼠對外界刺激反應遲鈍、活動力減弱。造模1周內，小鼠共死亡6只，大鼠共死亡4只，后在2～12周過程中并無死亡。經比較(χ2=0.48，P=0.488)尚不能認為兩者的總體存活率不等。

2.4腎功能、24 h尿蛋白定量比較

2.4.1血清肌酐：2周后，模型組大鼠、小鼠的肌酐值分別顯著高于假手術組(P<0.05)，5/6腎切除慢性腎衰腎纖維化模型制造成功。術后4周內，5/6腎切除SD大鼠組和C57小鼠組，肌酐呈下降趨勢，在4～12周內，兩個模型組的肌酐均呈上升趨勢。8～12周內，SD大鼠組的肌酐上升速率減小，而C57小鼠組的肌酐值上升速率仍較快(圖1)。

注：與大鼠假手術組比較，*P<0.05；與小鼠假手術組比較，#P<0.05；圖1　各組大小鼠肌酐變化趨勢Note：compared with SOR-R,*P<0.05；compared with SOR-M,#P<0.05；Fig.1　Variation tendency of serum creatinine in each group of rats and mice

2.4.2尿蛋白定量：術后4周，C57小鼠5/6腎切除組的尿蛋白定量大于假手術組(P<0.05),4～12周內，模型組尿蛋白定量呈現緩慢上升趨勢。而大鼠5/6腎切除組于4~8周內尿蛋白定量大幅上升，于8～12周內趨于穩定。5/6腎切除大鼠模型組總體尿蛋白定量大于小鼠模型組(圖2)。

圖2　各組大小鼠24 h尿蛋白定量變化趨勢Fig.2　Variation tendency of urine protein quantitation in each group of rats and mice

注：與大鼠假手術組比較，*P<0.01；與小鼠假手術組比較，#P<0.01；圖3　各組大小鼠尿素氮變化趨勢Note：compared with SOR-R，*P<0.01；compared with SOR-M,#P<0.01；Fig.3　Variation tendency of urea nitrogen in each group of rats and mice

2.4.3尿素氮：術后4周大、小鼠5/6腎切除組的尿素氮值均與其對照組存在差異顯著性(P<0.01)。4～12周內5/6NX小鼠組尿素氮持續上升，而5/6NX大鼠組尿素氮趨于平穩(圖3)。

2.5體重、殘腎質量

2.5.1體重：5/6NX組小鼠在術后兩周內體重下降較明顯。與假手術組相比，術后12周內， 5/6NX小鼠組的體重上升緩慢。而5/6NX大鼠組在術后12周內表現為體重繼續上升，其體重增長趨勢與假手術組大鼠相近(圖4，5)。

圖4　小鼠組體重變化趨勢Fig.4　Variation tendency of body weight in the mice

圖5　大鼠組體重變化趨勢Fig.5　Variation tendency of body weight in the rats

2.5.2殘腎質量：假手術組：腎組織呈深紅色、表面光滑，大小正常。5/6腎切除組：殘腎組織呈淺紅色，體積變大，向外凸出，腎周圍包膜與腎臟廣泛粘連，難以剝離，皮質色較淡。縱向切開后，皮質和髓質分界不清晰。5/6腎切除2周后，與假手術組相比，模型組左腎重/體重出現了明顯下降(P<0.01)。而隨著術后時間推移，左腎重/體重值均出現上升趨勢。術后12周，左腎重/體重值與假手術組較為接近(表1)。

2.6α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達

5/6腎切除組(5/6NX組)殘腎腎間質、小管的α-SMA的表達高于假手術組。12周時，小鼠5/6NX組的α-SMA表達量明顯小于大鼠5/6NX組(P<0.05)。(圖6見彩插4，表2)

2.7腎組織Masson染色

術后12周Masson染色：5/6NX組出現了腎小球硬化、萎縮變形，系膜細胞增多，腎小管擴張、排列紊亂改變，部分腎間質纖維化。假手術對照組未見上述改變，腎小球及腎小管形態正常。經Mann-Whitney U檢驗，5/6NX組膠原纖維陽性率高于假手術組(P<0.01)。(圖7；圖8見彩插4)

表1　 各組大小鼠殘腎重/體重

注：與大鼠假手術組4周相比，*P<0.01；與大鼠假手術組8周相比，#P<0.01；與大鼠假手術組12周相比，△P<0.01；與小鼠假手術組4周相比，**P<0.01；與小鼠假手術組8周相比，##P<0.01；與小鼠假手術組12周相比，△△P<0.01；

Note: compared with SOR-R in the forth week，*P<0.01；compared with SOR-R in the eighth week，#P<0.01；compared with SOR-R in the twelfth week，△P<0.01；compared with SOR-M in the forth week，**P<0.01；compared with SOR-M in the eighth week，##P<0.01；compared with SOR-M in the twelfth week，△△P<0.01；

表2　各組大小鼠α-SMA表達量

注：與大鼠假手術組4周相比，*P<0.01；與大鼠假手術組8周相比，#P<0.01；與大鼠假手術組12周相比，△P<0.01；與小鼠假手術組4周相比，**P<0.01；與小鼠假手術組8周相比，##P<0.01；與小鼠假手術組12周相比，△△P<0.01；與大鼠5/6腎切除組12周比較，☆P<0.01；

Note: compared with SOR-R in the forth week，*P<0.01；compared with SOR-R in the eighth week，#P<0.01；compared with SOR-R in the twelfth week，△P<0.01；compared with SOR-M in the forth week，**P<0.01；compared with SOR-M in the eighth week，##P<0.01；compared with SOR-M in the twelfth week，△△P<0.01；compared with 5/6NX-R in the twelfth week，☆P<0.01；

注：與大鼠假手術組比較,*P<0.01；與小鼠假手術組比較，#P<0.01圖7　各組大小鼠腎組織膠原陽性率比較Note：compared with the SOR-R group,* P<0.01；Compared with the SOR-M group,#P<0.01.Fig.7　Comparison of positive rates of collagen in the renal tissues in each group of rats and mice

4討論

慢性腎功能不全疾病進展的病理表現為腎小管間質纖維化，臨床表現為進行性腎功能減退。因此在基礎和臨床研究中，慢性腎衰腎纖維化動物模型應盡量符合以上兩點。近來，國內外研究者多運用單側輸尿管結扎術(UUO)和5/6腎切除動物模型來模擬人類慢性腎衰疾病過程,而其主要弊端為單側腎臟結扎后，健側腎臟較大程度代償而使腎功能表現為術后一段時間內減退，而較少出現進行性腎功能減退。

目前國內應用5/6腎切除大鼠腎衰模型進行實驗研究較多。Brenner等對大鼠進行5/6腎切除，用微穿刺等方法證實該模型能夠表現所謂“三高”等血流動力學的變化，符合高濾過致腎衰說[3]。因其具有接近臨床腎衰病變進展過程, 操作簡單易行、重復性好等優點，為諸多學者廣泛采用。研究者證實，腎大部切除術在不同動物模型中表現不同，例如，狒狒、狗、兔的殘腎均不會發生腎小球硬化，而75%腎切除的狗不會出現腎功能惡化[4,5]，同時，在腎大部切除術中，小鼠的腎單位減少模型大致與大鼠相同[4]。因小鼠的基因組與人類基因組有很高的同源性，組織器官結構和細胞功能與人類相近，研究中應盡量選擇小鼠。

故對國內未進行廣泛研究和應用的小鼠5/6腎切除腎衰竭動物模型進行初探，并與大鼠5/6腎切除慢性腎衰模型進行比較，是完善腎大部切除術研究運用的重要方面。

我們根據Morrison等提出的5/6腎切除造模過程中可能出現的問題及解決方案，進行了實驗。采用5/6腎切除C57小鼠(5/6NX-M)與5/6腎切除SD大鼠(5/6NX-R)進行比較實驗，并設立了相應的假手術組。

大小鼠體重相去甚遠，術中操作各存異同。5/6腎切除造模步驟在大小鼠術中實施基本相同。大鼠形態大，手術簡易，耗時較少，即使出血量大，及時止血也能避免出現休克、死亡。而考慮到小鼠體重較小，更容易在5/6NX的一期手術面臨出血、應激、休克、死亡等一系列風險，更應創造精細、完備的手術條件。除按照小鼠體重精確控制麻藥量外，術中應做到切口小、及時止血、迅速縫合及注意術后保暖等事項。我們采用明膠海綿止血，10 min內殘腎基本不滲血。術中放置成人尿墊，防止術中低體溫；術后采用暖燈照射保暖，使小鼠盡快蘇醒。從術后2周的存活率分析，大、小鼠的總體成活率不存在差異，后續研究或可增大樣本量。

從5/6腎切除大、小鼠體重結果觀察，很難作出其與CRF疾病階段相關的判斷。由于小鼠本身體重較小，腎切除引起的急性腎衰或可導致生長的停滯和體重的減輕。故即使術后(2～12)周內小鼠因自身代償恢復了正常生長，其生長趨勢仍異于假手術組，若因此建立體重與慢性腎衰的相關性恐較難排除急性腎衰的影響。而術后(2～12)周，5/6NX組大鼠的體重趨勢與假手術組基本相近，生長規律大致恢復，然體重仍小于假手術組。因此，動態體重的差異表明急性腎衰對5/6NX小鼠組的影響大于大鼠。

5/6腎切除后，大、小鼠模型組肌酐值均出現了上升、下降、再上升的變化趨勢，完整地模擬了從急性腎衰到腎功能代償、失代償的疾病過程。8～12周內，5/6NX大鼠組肌酐上升幅度減小，或由于大鼠從急性腎衰中已經恢復，且腎功能趨于穩定。這與Gretz N等的研究基本相符。Boudet等[6]也研究認為當腎功能達某種程度后，其進展的速率是一樣的。而5/6NX小鼠組肌酐值仍于8～12周內進行性上升，并無穩定跡象。對尿素氮的動態監測中亦發現5/6NX組的大、小鼠的尿素氮值明顯高于相應假手術組。而異于5/6NX大鼠組的是小鼠組尿素氮值仍于術后(8～12)周內明顯上升，這與肌酐值的動態變化規律存在一定相關。在5/6腎切除后，大、小鼠的24 h尿蛋白定量相比假手術組出現了明顯差異，5/6NX大鼠組的尿蛋白定量出現了大幅上升，并與12周左右穩定，基本符合慢性腎衰病變發展的特點。故從腎小球濾過功能的結果看，兩組模型的疾病發展進程存在一定差異，我們可以認為大小鼠模型組的殘余腎損毀與代償平衡存在差異，即5/6NX小鼠組的慢性腎衰病程或長于大鼠模型組。故后續可延長對5/6NX小鼠的觀察時間，同時，對腎衰各期時長確定的研究也十分必要。

研究采用α-SMA作為腎小管間質纖維化的評價指標。α-SMA是平滑肌細胞和肌成纖維細胞的特征性蛋白，在EMT(上皮細胞向間充質細胞轉化)過程中，α-SMA逐漸地在腎間質和腎小管上皮細胞中表達。(4～12)周內，α-SMA在大、小鼠模型的表達量明顯上升，這符合慢性腎功能衰竭腎纖維化的疾病過程。12周末，5/6NX小鼠組α-SMA的表達量顯著小于5/6NX大鼠組，或與5/6NX大、小鼠處于各自慢性腎功能衰竭不同的疾病階段有關。

綜上所述，5/6腎切除小鼠慢性腎衰模型于術后出現了腎單位減少引起的腎功能衰竭、殘腎代償及腎小管間質纖維化等改變，模型建立成功，其存活率與大鼠組不存在差異。而在與5/6NX大鼠組的比較中發現，兩者慢性腎衰疾病進程存在差異，后續研究可根據本實驗結果延長對病程的觀察時間、縮短監測節點的時間間隔，以探索小鼠動物模型的更多特點。實驗中應根據研究周期的長短，結合不同動物模型出現的腎衰平穩期，選擇運用適當的動物模型進行研究。

參考文獻：

[1]Ortiz A, Covic A, Fiser D, et al. Epidemiology, contributors to, and clinical trials of mortality risk in chronic kidney failure [J]. Lancet, 2014, 383(9931): 1831-1843.

[2]Platt R, Roscoe MH, Smith FW. Experimental renal failure [J]. Clin Sci, 1952, 3: 217-231.

[3]Brenner BM. Nephron adaptaion to renal injury of ablation [J]. Am J Physiol, 1985, 249(Pt 2): F324-337.

[4]Provoost AP, Baudoin P, De Keijzer MH, et al. The role of nephron loss in the progression of renal failure: experimental evidence [J]. Am J Kidney Dis, 1991, 17: 27-32.

[5]Fine LG, Woolf AS, Gallego C, et al. Of rats and men: the need for more convincing clinical studies on progression of renal diseases [J]. A m J Kidney Dis, 1991, 17: 258-260.

[6]Boudet J, Man NK, Pils P, et al. Experimental chronic renal failure in the rat by electrocoagulation of the renal cortex [J]. Kidney lnt, 1978, 14(1): 82-86.

〔修回日期〕2015-07-10

研究報告

Comparison between the 5/6 nephrectomy SD rat and C57 mouse

models of chronic renal failure

YU Ke-na, MA Zhi-heng, ZHONG Li-ping, HE Lin-qun

(Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200021, China)

【Abstract】ObjectiveTo find the similarities and differences between SD rat and C57 mouse models of chronic renal failure established by 5/6 nephrectomy，and select an appropriate experimental animal for the study of the treatment and prevention of chronic renal failure. Methods 60 SD rats and C57 mice were randomly and equally divided into 5/6 nephrectomy group and sham operatied group. The mice and rats were killed at 4 weeks, 8 weeks and 12 weeks after the operation, respectively. Serum and renal tissue samples were collected for the detection and analysis of renal function and α-SMA. Results There was no significant difference in the survival rates between the rat and mouse models (P>0.05). The serum creatinine and urea nitrogen in the 5/6NX rat group showed a stable state at 8-12 weeks, which was different from that of the 5/6NX mouse group. ConclusionsA 5/6 nephrectomy mouse model of chronic renal failure is successfully established. Although both 5/6 NX mouse and rat groups appear progressive renal failure after the operation, their disease processes are not quite the same. In clinic, appropriate experimental animals should be selected according to the length of the observation period in order to accurately show the disease states.

【Key words】Chronic renal failure; 5/6 nephrectomy; Rat; Mouse; Model， animal

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.008.010

【中圖分類號】R-33

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856(2015) 08-0048-06

[通訊作者]何立群(1959-)，主任醫師，博士研究生導師，博士學位，主要從事中醫藥干預慢性腎臟疾病的臨床與實驗室研究工作。E-mail： heliqun59@163.com。

[作者簡介]余柯娜(1989-)，碩士研究生在讀，主要從事中西醫結合治療慢性腎臟病的臨床及基礎研究工作。E-mail： janice1989@126.com。

[基金項目]國家自然科學基金(81373615)；國家臨床重點專科；國家中醫藥管理局重點學科、重點專科。