斑石鯛(Oplegnathus punctatus)雌、雄魚核型及Ag-NORs帶型分析*

薛 蕊 安 皓 劉清華 肖志忠 王彥豐 李 軍①

(1. 中國科學院海洋研究所 中國科學院實驗海洋生物學重點實驗室 青島 266071; 2. 中國科學院大學 北京100049; 3. 青島海洋科學與技術國家實驗室 海洋生物學與生物技術功能實驗室 青島 266237)

魚類染色體及其核型研究是魚類細胞遺傳學的重要組成部分之一, 對研究魚類變異、分類、系統演化、性別決定、雜交育種以及對環境污染的監測等方面具有重要意義(樓允東, 1997)。我國在 20世紀 70年代才開始對魚類染色體核型進行較為詳盡的研究,80年代后期隨著海水養殖業的發展, 海水魚類核型相關研究領域才得到重視(趙金良, 2000)。

斑石鯛(Oplegnathus punctatus), 俗稱斑鯛、花金鼓、黑金鼓等, 隸屬鱸形目(Perciformes), 石鯛科(Oplegnathidae), 石鯛屬(Oplegnathus), 主要分布于朝鮮、日本、中國臺灣以及南海、東海、黃海等海域(孟慶聞等, 1995)。斑石鯛體態優美, 肉質細膩, 素有“刺身絕品”之稱, 具有很高的觀賞價值和經濟價值。對斑石鯛的報道目前主要集中在早期發育(Park et al,2015)、成魚養殖(The Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, 2015)、雜交育種(Kwun et al, 2010)、以及疾病和免疫(Yanagida et al, 2008; Dong et al, 2010; Shuang et al,2013)等方面, 有關斑石鯛細胞遺傳學方面的研究目前尚未見報道。本文對斑石鯛雌、雄魚染色體核型以及核仁組織者進行了實驗研究, 旨在為進一步開展斑石鯛遺傳育種等工作奠定基礎, 并為鱸形目魚類細胞遺傳學研究提供更多資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用斑石鯛取自煙臺市明波水產有限公司,為 15月齡幼魚, 共計 9尾實驗魚, 體重為 246.2—398.6g, 體長為 22.8—24.6cm。解剖實驗魚性腺制作石蠟切片并染色, 根據顯微觀察結果判定雌雄。

1.2 染色體標本的制備

采用林義浩(林義浩, 1982)的方法并稍作修改:在室溫下按 8—10μg/g的劑量于實驗魚胸鰭基部注射PHA(Solarbio, 北京), 20h后于胸鰭基部注射秋水仙堿(Solarbio, 北京)劑量為 2.5—5μg/g。過 4h用丁香油水門汀麻醉并斷尾放血 30min, 之后解剖取頭腎, 0.8%生理鹽水沖洗后用鑷子反復撕拉使其細胞游離, 350目尼龍篩絹過濾收集獲得細胞懸液, 在4°C下于 0.075 mol/L KCl溶液中低滲處理 30min,經1000r/m離心10min后去上清, 經1次預固定處理后, 用卡諾氏固定液(甲醇 : 冰醋酸 = 3 : 1, V : V)在–20°C下進行3次固定處理, 每次30min, 之后采用冷片法滴片并空氣干燥過夜。過夜干燥后的染色體玻片用10% Giemsa染液染色40min, 蒸餾水沖洗后自然干燥。

1.3 核型分析

雌、雄魚各選取50個染色體中期分裂相進行染色體計數, 并選出 10個數目完整且分散良好的中期分裂相, 用 Nikon-ES-100及Nikon-DS-Fi1顯微拍照系統拍照、放大和測量, 統計染色體實際長度、相對長度以及臂比等數據, 利用Photoshop CS3截取核型圖, 染色體的類型按照 Levan等(1964)的標準確定。染色體實際長度根據與拍照時的標志物長度比對獲得, 染色體相對長度計算公式為: 染色體相對長度=(單條染色體實際長度/染色體組實際長度總和)×100%, 染色體臂比是指單條染色體長臂與短臂之比。

1.4 染色體Ag-NORs及帶型分析

采用Howell等(1980)的快速銀染法制片, 向每個樣片上滴加2滴2%的明膠溶液和4滴50%的AgNO3溶液, 蓋上蓋玻片后放到 65°C的水浴鍋鍋蓋上1—2min, 待整張片子呈棕褐色時去掉蓋玻片并迅速用流水沖洗, 自然干燥后鏡檢。

顯微鏡觀察并記錄 100個間期細胞的 Ag-NORs個數, 選取 10個染色體數目完整且分散良好的中期分裂相, 用Nikon-ES-100及 Nikon-DS-Fi1顯微拍照系統拍照、放大和測量, 確定 Ag-NORs個數、位置及大小, 并用Photoshop CS3經剪貼、重排等操作獲取Ag-NORs帶型圖, 并利用Excel 2007繪制模式圖。

2 結果

2.1 斑石鯛核型分析

我們首先通過石蠟切片的方法對實驗魚的性別進行了鑒定, 在9尾斑石鯛中雄魚4尾, 雌魚5尾。對分散良好的斑石鯛雌、雄魚中期分裂相觀察顯示,雄性斑石鯛具有一條體型巨大的特異的中部著絲粒染色體(圖 1a), 可視為雄性斑石鯛的異形性染色體,而雌性斑石鯛不具有這種異形染色體(圖1b), 雌、雄魚均未發現次縊痕和隨體的存在。

圖1 斑石鯛雄魚(上)和雌魚(下)染色體中期分裂相及其核型Fig.1 The metaphase chromosomes and karyotype of O. punctatus圖a中箭頭所指為斑石鯛雄魚異形染色體

挑選斑石鯛雌、雄魚各50個分散良好的中期分裂相進行計數, 統計結果見表 1。雄性斑石鯛中期分裂相染色體眾數為47, 占所觀察分裂相的66%, 核型為2n=47, 1m+2sm+44t, NF=50; 雌性斑石鯛染色體眾數為 48, 比例占到 68%, 核型為 2n=48, 2sm+46t,NF=50。

表1 斑石鯛雌、雄魚染色體數目統計結果Tab.1 Chromosome number of both sexes in O. punctatus

2.2 斑石鯛染色體相對長度分析

對選取的雌、雄魚各10個分散良好、數目完整的分裂相進行拍照、放大和測量, 數據統計結果見表2。雄性斑石鯛具有 1條巨大的異形染色體、1對亞中部著絲粒染色體以及 22對端部著絲粒染色體; 雌性斑石鯛具有1對亞中部著絲粒染色體和23對端部著絲粒染色體。雄性斑石鯛染色體實際長度最長為(2.55±0.21)μm, 最短為(0.56±0.08)μm; 而雌性斑石鯛染 色 體 實 際 長 度 范 圍 在 (0.59±0.09)μm 與 (1.75±0.11)μm 之間。雄性斑石鯛異形染色體相對長度為(10.33±0.86), 最小染色體的相對長度是(2.28±0.30),異形染色體相對長度達到其它染色體的 2—5倍, 只有1條, 沒有其它染色體與之配對; 雌性斑石鯛染色體相對長度最大為(6.87±0.42), 最小為(2.30±0.37)。

2.3 斑石鯛Ag-NORs帶型分析

顯微觀察100個斑石鯛雌、雄魚中期分裂相, 發現其中具有Ag-NORs位點的占73%。Ag-NORs位點的數目在不同分裂相中呈現多態性, 為 1—2個, 其中具有 2個 Ag-NORs的分裂相比例高達 72.6%, 其Ag-NORs皆位于1對sm染色體短臂端部, 呈短棒狀;在具有1個Ag-NORs的分裂相中, Ag-NORs皆位于其中一條sm染色體短臂上(見表3)。

表2 斑石鯛中期染色體實際長度與相對長度Tab.2 Actual length and relative length of metaphase chromosome in O. punctatus

斑石鯛間期細胞核中銀染核仁的數目同樣呈現多態性, 其數目為1—3個, 其中含有2個核仁的間期細胞核出現頻率最高, 為60%, 含有1個和3個核仁的細胞核比例分別為27%和13%, 并且核仁的大小與數目呈反比(見圖2和表3)。

因此確定斑石鯛 Ag-NORs數目為 2 , 位于 1對 sm 染色體短臂上, 為端部 Ag-NORs, 斑石鯛Ag-NORs分裂相及其核型見圖3, 測量計算銀染部位長度并繪制模式圖見圖4。

圖2 斑石鯛間期細胞核Ag-NORsFig.2 The Ag-NORs in nucleus of O. punctatus

表3 斑石鯛Ag-NORs情況統計Tab.3 Summary of Ag-NORs in O. punctatus

圖3 斑石鯛雄魚(上)和雌魚(下)Ag-NORs分裂相及其核型Fig.3 The Ag-NORs metaphase chromosomes and karyotype of O. punctatus箭頭所指為Ag-NORs位置

圖4 斑石鯛雄魚(左)和雌魚(右)Ag-NORs模式圖Fig.4 Schema of Ag-NORs in O. punctatus

3 討論

據不完全統計, 截至 2006 年, 我國已進行核型研究的海水魚類僅有 77 種, 其中以鱸形目魚類研究最多(卓孝磊等, 2007)。在已進行研究的鱸形目魚類中, 絕大多數魚類的染色體數目為 2n=48, 且不同種鱸形目魚類的核型公式呈現多樣性, 中部、端部、亞中部以及亞端部著絲粒染色體皆有出現, 但極少有雌、雄魚核型相異以及異形性染色體的報道。本研究的斑石鯛是鱸形目石鯛科石鯛屬的一種魚類, 雌、雄魚核型相異, 其核型公式為雄性 2n=47,1m+2sm+44t, NF=50; 雌性 2n=48, 2sm+46t, NF=50,且雄魚具有一條巨大的中部著絲粒異形性染色體,屬于雄性配子異形, 可能是性染色體Y。

本研究中斑石鯛除異形性染色體外, 雌、雄魚染色體的相對長度分別在 (2.30±0.37) — (6.87±0.42)和(2.28±0.30) — (6.64±0.62)之間, 染色體相對長度明顯偏小, 這是因為魚類在脊椎動物分類系統中處于較低位態, 所以染色體數目多且小(卓孝磊等, 2007)。小島吉雄(1979)在研究染色體時對真骨魚類進行了劃分, 提出了3個演化類群分別為低位類、中位類和高位類, 同時李樹深(1981)認為, 在特定的分類階元中,根據染色體臂數以及端部著絲粒染色體個數的多寡,可以將其分為原始類群、較特化類群以及特化類群。本研究中斑石鯛雌魚染色體數目為 2n=48, 大多數是端部著絲粒染色體, 染色體臂數少, 因此在不考慮斑石鯛雄性異形染色體的情況下, 可認為其在魚類演化系統中屬于高位類, 是較特化類群。此外, 一般認為鱸形目魚類中原始類群的核型為2n=48t, NF=48(徐冬冬等, 2012), 其它特化類群的核型是通過羅伯遜易位及其它染色體結構重排方式形成的(趙金良, 2000)。本研究中斑石鯛雌、雄魚2n=48保持不變, 而NF=50,即染色體臂數比原始類群有所增加, 因此推測是通過除羅伯遜易位之外的染色體重排方式形成的(卓孝磊等, 2007)。本研究中斑石鯛雌、雄魚染色體個數與其同屬近緣種條石鯛(Oplegnathus fasciatus)一致, 但條石鯛中含有一對中部著絲粒染色體(徐冬冬等,2012), 而在斑石鯛相對應的是一對亞中部著絲粒染色體, 這種細微差別有可能來源于實驗手段差異或者顯微測量造成的誤差, 但更大的可能性是來源于這兩個近緣物種在進化時間以及染色體結構重排程度等方面的差異。

在已考察核型的魚類中, 具有異形性染色體的種類不足 10%(常重杰等, 2002), 但其性別決定類型卻非常復雜, 幾乎囊括了已知脊椎動物的所有類型(Graves et al, 2010), 包括 XX/XY型、ZW/ZZ型、Z0/ZZ型、XX/X0型、X1X1X2X2/X1X2Y型以及常染色體決定型等6個類別, 其中以XX/XY型和ZW/ZZ型最為常見, 而X1X1X2X2/X1X2Y型僅在魚類中有報道(Graves et al, 2010)。目前我國國內已報道的具有異形性染色體的海水魚類僅有5種, 分 別是斑尾復 鰕 虎魚(Synechogobius ommaturus) (王金星等, 1994)、斑頭魚(Agrammus agrammus) (鄭家聲等, 1997)、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis) (周麗青等, 2005)、條石鯛(Oplegnathus fasciatus) (徐冬冬等, 2012; Xu et al,2013)以及尖吻(Rhynchopelates oxyrhynchus) (舒琥等, 2013)。國外學者則對魚類性別染色體研究得更為深入, Kitano等(2009)發現日本海三刺魚(Gasterosteus aculeatus)群體的雌魚2n=42, 雄魚2n=41且具有一條巨大的異形性染色體, 常染色體和性染色體基因的熒光原位雜交顯示異形性染色體Y來源于X1X2的融合, 其染色體的性別決定類型為X1X1X2X2/X1X2Y型,認為這種區別于太平洋群體的性別決定機制有可能與 150—200萬年前日本海地區地質變化造成的地理隔離有關。此外, 本研究中報道的斑石鯛雌、雄魚核型與近緣物種條石鯛(徐冬冬等, 2012; Xu et al, 2013)的報道類似, 后者已通過 C-帶以及重復序列的熒光原位雜交試驗證實Y染色體來源于X1X2的早期融合,確定其性別的染色體決定類型為 X1X1X2X2/X1X2Y型。本研究中斑石鯛雄性具有異形性染色體且染色體數目比雌性少一條, 基本符合X1X1X2X2/X1X2Y型特征, 因此可以初步推測其性別的染色體決定類型為X1X1X2X2/X1X2Y型, 但仍需要通過進一步的細胞遺傳學手段來予以證實。

Ag-NORs是魚類較為成熟的顯帶技術之一, 其數目、形態以及分布情況是親緣關系和染色體進化的指標(卓孝磊等, 2007)。本研究發現斑石鯛雌、雄魚具有單對Ag-NORs, 符合脊椎動物Ag-NORs的原始特征(Schmid, 1978)。另外, 斑石鯛雌、雄魚的單對Ag-NORs分別位于第1對和第2對亞中部著絲粒染色體的短臂末端, 呈短棒狀, 在其它鱸形目魚類的報道中, Ag-NORs位于近著絲粒或端粒區域: Rocha等(2008)報道了6種笛鯛科魚類(Perciformes, Lutjanidae)的Ag-NORs, 其中5個物種的單對Ag-NORs位于1對長臂近著絲粒位置處, 而另一物種具有 2對Ag-NORs, 其中之一與上述位置一致, 另外1對則位于1對染色體的端粒位置處; Neto等(2011)報道了鱸形目石鱸科(Perciformes, Haemulidae)2種魚類的細胞遺傳學分析結果, 二者皆具有單對 Ag-NORs, 分別位于 1對染色體的近著絲粒區次縊痕處。Ag-NORs通常分布于染色體的次縊痕和隨體區域, 許多報道體現了次縊痕和核仁組織者的對應關系(Neto et al,2011; 范瑞等, 2014)但是在本研究中 Ag-NORs位置并未發現次縊痕或隨體的存在, 楊坤等(2013)在對麥穗魚(Pseudorasbora parva)的研究中也有此類報道,后者推測其染色體上次縊痕的結構可能已然存在,只是還沒進化到從細胞學上可辨別的程度。此外, 本研究發現斑石鯛Ag-NORs有時只出現在同源染色體的一條上, 許多學者有類似報道(Caputo et al, 2001;范瑞等, 2014), 認為這是染色體的活性異形現象, 其實質是同源染色體上 rRNA基因轉錄活性存在差異(范瑞等, 2014)。

王金星, 趙小凡, 1994. 斑尾復虎魚的染色體研究. 海洋科學, (4): 47—49

劉寶良, 趙奎峰, 王國文等, 2015. 珍珠龍膽石斑魚和斑石鯛工廠化循環水混合養殖方法. China: CN104396841-A

李樹深, 1981. 魚類細胞分類學. 生物科學動態, (2): 8—15

楊 坤, 祝東梅, 王衛民, 2013. 麥穗魚鰭條組織培養及染色體Ag-NORs和C-帶研究. 南方水產科學, 9(3): 20—25

范 瑞, 姜志強, 李雅娟等, 2014. 太平洋鱈染色體核型及銀染分析. 水生生物學報, 38(1): 115—120

林義浩, 1982. 快速獲得大量魚類腎細胞中期分裂相的 PHA體內注射法. 水產學報, 6(3): 201—208

卓孝磊, 鄒記興, 2007. 我國海水魚類核型及染色體顯帶研究進展. 熱帶海洋學報, 26(5): 73—80

周麗青, 楊愛國, 柳學周等, 2005. 半滑舌鰨染色體核型分析.水產學報, 29(3): 417—419

鄭家聲, 王梅林, 戴繼勛, 1997. 斑頭魚的核型及性染色體研究. 遺傳, 19(增刊): 61—62

孟慶聞, 蘇錦祥, 繆學祖, 1995. 魚類分類學. 北京: 中國農業出版社, 734—756

趙金良, 2000. 我國海水魚和咸淡水魚染色體組型研究概述.上海水產大學學報, 9(4): 344—347

徐冬冬, 尤 鋒, 樓 寶等, 2012. 條石鯛雌雄魚核型及 C-帶的比較分析. 水生生物學報, 36(3): 552—557

常重杰, 杜啟艷, 2002. 魚類的性別決定和性染色體. 淡水漁業, 32(2): 56—58

舒 琥, 黃萃瑩, 劉 麗等, 2013. 6種科(Teraponidae)經濟魚類的染色體組型研究. 海洋與湖沼, 44(5): 1372—1377

樓允東, 1997. 中國魚類染色體組型研究的進展. 水產學報,21(增刊): 82—96

小島吉雄, 1979. 水產生物及遺傳育種. 東京: 水交出版社,46—62

Caputo V, Machella N, Nisi-Cerioni P et al, 2001. Cytogenetics of nine species of Mediterranean blennies and additional evidence for an unusual multiple sex-chromosome system in Parablennius tentacularis (Perciformes, Blenniidae).Chromosome Research, 9(1): 3—12

Dong C F, Weng S P, Luo Y W et al, 2010. A new marine megalocytivirus from spotted knifejaw, Oplegnathus punctatus, and its pathogenicity to freshwater mandarinfish,Siniperca chuatsi. Virus Research, 147(1): 98—106

Graves J A M, Peichel C L, 2010. Are homologies in vertebrate sex determination due to shared ancestry or to limited options?. Genome Biology, 11(4): 205

Howell M W, Black D A, 1980. Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia, 36(8): 1014—1015

Kitano J, Ross J A, Mori S et al, 2009. A role for a neo-sex chromosome in stickleback speciation. Nature, 164(7267):1079—1083

Kwun H J, Kim J K, 2010. Occurrence of natural hybrid between Oplegnathus fasciatus and Oplegnathus punctatus from the south sea of Korea. Korean Journal of Ichthyology, 22(3):201—205

Levan A, Fredga K, Sandberg A A, 1964. Nomenclature for centromeric position on chromosomes. Hereditas, 52(2):201—220

Neto C C M, Cioffi M Belo, Bertollo L A C et al, 2011.Molecular cytogenetic analysis of Haemulidae fish(Perciformes): evidence of evolutionary conservation.Journal of Experimental Marine Biology and Ecology,407(1): 97—100

Park J M, Lee S H, Yun S M et al, 2015. Egg development and morphology of larvae and juveniles of spotted knifejaw,Oplegnathus punctatus. Korean Journal of Ichthyology,27(2): 71—77

Rocha é C, Molina W F, 2008. Cytogenetic analysis in western Atlantic snappers (Perciformes, Lutjanidae). Genetics and Molecular Biology, 31(2): 461—467

Schmid M, 1978. Chromosome banding in Amphibia II.Constitutive heterochromatin and nucleolus organizer regions in Ranidae, Microhylidae and Rhacophoridae.Chromosoma, 68(2): 131—148

Shuang F, Luo Y W, Xiong X P et al, 2013. Virions proteins of an RSIV-type megalocytivirus from spotted knifejaw Oplegnathus punctatus (SKIV-ZJ07). Virology, 437(2): 89—99

Xu D D, Lou B, Bertollo L A C et al, 2013. Chromosomal mapping of microsatellite repeats in the rock bream fish Oplegnathus fasciatus, with emphasis of their distribution in the neo-Y chromosome. Molecular Cytogenetics, 6: 12

Yanagida T, Palenzuela O, Hirae T et al, 2008. Myxosporean emaciation disease of cultured red sea bream Pagrus major and spotted knifejaw Oplegnathus punctatus. Fish Pathology,43(1): 45—48