脂肪活性檢測方法的研究進展

裴進洪 綜述 李青峰 審校

脂肪活性檢測方法的研究進展

裴進洪 綜述 李青峰 審校

脂肪細胞活性檢測方法用于在體外判斷脂肪細胞的活性，包括一般細胞活性檢查法，和脂肪細胞特異性檢驗法。我們對常用的脂肪細胞活性檢測方法的原理、特性，以及相關應用情況進行綜述。

脂肪細胞活性檢測特異性

1893年，Neuber首先提出了自體脂肪移植的概念。上世紀80年代，隨著脂肪抽吸技術的出現，自體脂肪顆粒的獲取更加簡便。1986年，Illouz[1]將脂肪抽吸術所獲得的脂肪，注射到軟組織缺損的部位，開創了脂肪細胞移植。自體脂肪細胞移植無免疫及排斥反應，取材容易、組織損傷小，同時可起到供區減脂瘦身的作用。但脂肪移植的存活率較低，且效果難以預測，移植的脂肪呈現進行性體積縮小。為了尋找影響脂肪活性的因素，從而提高移植脂肪的存活率，出現了各種檢測脂肪細胞活性的方法。主要有通過檢測細胞膜完整性的臺盼藍染色、熒光染色，檢測亞細胞器功能的MTT法、XTT法、CCK-8法、alamarBlue、JC-1、溴-脫氧尿嘧啶摻入法，檢測細胞酶功能的LDH釋放法、GAPDH，以及檢測細胞死亡標志物的FITC Annexin V等。本文對常用的脂肪細胞活性檢測方法的原理、特性，以及相關應用情況進行綜述。

1 細胞膜完整性檢測

1.1 臺盼藍染色

臺盼藍染色是組織和細胞培養中最常用的死細胞鑒定方法之一。胞膜結構完整的正常活細胞能夠排斥臺盼藍，因此臺盼藍不能夠進入胞內，而死亡細胞或細胞膜不完整的細胞可被臺盼藍染成藍色。通常認為，細胞膜完整性喪失，即可認為細胞已經死亡。臺盼藍與中性紅作用相反。

臺盼藍染色操作簡便，可快速區分活細胞和死細胞，費用低廉。隨著流式細胞儀的發展，將實驗結果數據化變得簡便而準確。

Hwang等[2]應用臺盼藍染色法檢測了脂肪細胞活性在不同冷藏條件下的變化，發現該方法由于計數時焦平面的選擇、顆粒識別的準確性等，易高估細胞活性。臺盼藍染色顯示的活細胞，會在熒光顯微下呈現為死細胞。所以臺盼藍染色應和其他檢測方法同時應用，以提高準確性。

1.2 熒光染色法

熒光染料在吸收紫外線或可見光后，能把短波長的光轉變為長波的可見光而反射出來，呈閃亮的鮮艷色彩。熒光染色法是利用熒光染料的這種性質來檢測細胞的活性。熒光染料主要分為不能滲透活細胞胞膜的PI（Propidium iodide）、EB（Ethidium bromide）、7-AAD，和能滲透活細胞胞膜的AO（Acridine Orange）等。熒光染色法能與另一種熒光染料或其他染料同時使用，如AO-EB雙染法等，可同時染色凋亡細胞和活性細胞，使分析實驗結果更簡便而準確。同時，由于靈敏度高，操作方便，被廣泛應用于熒光免疫、熒光探針、細胞染色等。但與其他基于熒光染料標記的實驗一樣，需要使用熒光顯微鏡或流式細胞儀。

1.2.1 FDA/PI

Son等[3]為了檢驗離心對脂肪細胞和脂肪干細胞活性的影響，采用FDA-PI染色法。FDA是能通過細胞膜的細胞酶底物，進入活細胞后，從無免疫熒光的FDA，被細胞酶轉換成綠色免疫熒光的“Fluorescin”，它是細胞活性的指標。它穿過死細胞膜的無序區域而到達細胞核，并嵌入細胞的DNA雙螺旋，從而產生紅色熒光。但Boyd等[4]認為，FDA/PI法影響因素過多，很難掌握，難以避免操作過程中的主觀因素。因此，該方法的檢測結果并不準確。

1.2.2 Calcein-AM和碘化丙啶（PI)免疫熒光試驗

Calcein-AM和碘化丙啶（PI）溶液，分別可對活細胞和死細胞進行染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯親脂性很高，可透過細胞膜，通過活細胞內的酯酶作用，能脫去AM基，產生的Calcein（鈣黃綠素），能發出強綠色熒光。因此，Calcein-AM僅對活細胞染色。另外，作為核染色染料的PI不能穿過活細胞的細胞膜。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞；用545 nm激發，則僅可觀察到死細胞。

與同類試劑比較，Calcein細胞毒性較低，不會抑制任何細胞的正常生理功能或動態變化[5]。Tai等[6]通過比較Calcein-AM/PI和Cr51檢測細胞毒性結果，發現與標準的Cr 51-釋放法所得結果相一致，因此認為使用Calcein活性檢測的實驗結果是十分可信的。但Calcein-AM的ester部位遇到水分會分解，使用后要在-20℃下密閉冷凍保存，并且PI有致癌可能，對操作者有一定的安全風險。

1.2.3 Perilipin免疫熒光染色

Perilipin是脂肪細胞脂滴表面富含有的蛋白，不僅在成熟脂肪細胞分化的前體脂肪細胞內起作用，在脂肪細胞內對甘油三酯的存儲和分解也具有重要的調控作用。Perilipin保護脂肪組織，減少水解，可影響脂肪細胞的活性及分化[7]。這種方法針對脂滴表面蛋白進行免疫熒光，對脂肪細胞活性檢測具有特異性。通過免疫熒光染色，可間接反映出細胞數量，脂滴周圍蛋白被染色，呈綠色的細胞為活細胞，未染色的為死細胞。Perilipin免疫熒光染色法是近年來檢測脂肪細胞活性的首選方法之一，具有特異性，操作簡便，可區分活細胞和死細胞，準確性高，可用流式細胞儀檢測，并且實驗結果可數據化，簡便而準確[8]。

2 亞細胞器功能檢測

2.1 MTT法、XTT法、CCK-8法

MTT法檢測原理：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶，能使外源性MTT還原為不溶水的藍紫色結晶甲瓚（Formazan），并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在540 nm或720 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。

MTT法使用方便，不需要放射性同位素和有機溶劑，檢測快速、靈敏度高、可重復性高、對細胞毒性小，并且價格低廉，成為細胞活性檢測最常用的方法。但是，因為MTT經還原所產生的甲瓚產物不溶于水，需被溶解后才能檢測，對實驗結果的準確性有一定的影響，而且溶解甲瓚的有機溶劑對操作者具有危害行。為了解決該問題，XTT、CCK-8等水溶性的四氮唑鹽類被應用于此類研究。

XTT的化學名為2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide，作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細胞還原成水溶性的橙黃色甲臜產物。當XTT與電子耦合劑（例如PMS）聯合應用時，其所產生的水溶性的甲臜產物的吸光度與活細胞的數量成正比。

CCK-8試劑中含有WST-8，化學名為2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽，用酶聯免疫檢測儀在450 nm波長處測定其光吸收值，可間接反應活細胞數量，其熒光原理與XTT、MTT相同。

XTT和MTT法使用方便、檢測快速、靈敏度高，XTT重復性優于MTT，但是XTT水溶液不穩定，需要低溫保存或現配現用。與MTT法相比，CCK-8和XTT法的費用較高，并且由于是貼壁培養的細胞，在讀吸光值時細胞培養板底部附著的細胞可能會對數值有一定的影響，因此在加入CCK-8的3～4 h后，將上清液重新吸取到另一干凈的酶標板中進行讀值，可提高檢測的準確性。

2.2 alamarBlue一步熒光測定法

alamarBlue為活細胞代謝指示劑，易溶于水，進入細胞后經線粒體酶促還原，產生熒光及顏色變化，可用于定量。此試劑的主要成分是一種氧化還原指示劑，在氧化狀態下呈現紫藍色，無熒光性；而在還原狀態下，呈粉紅或紅色熒光，其吸收峰為530～560 nm，散射峰為590 nm。

alamarblue特異性低，但靈敏度高，重復性好，結果差異小，使用方便，無需預先標記靶細胞及離心、洗滌步驟，適用于大批量樣品的高準確性自動測定。染料濃度不影響細胞正常代謝及基因表達，可在無菌條件下測定后繼續培養擴增細胞，有利于對培養細胞的連續監測及深入研究。另外，還可測定淋巴細胞增殖或化學物質的細胞毒性及細胞凋亡。含胎牛血清及酚紅的培養液也不干擾測定結果。但由于alamarBlue分解產物偏紅，不能用粉紅色培養基，并且培養時間也較長，試劑成本較高[9]。

2.3 JC-1

線粒體膜電位是檢測細胞活性的關鍵因素之一。線粒體膜電位下降是細胞凋亡早期的一個標志性指標。JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位（Mitochondrial membrane potential）的理想熒光親脂性陽離子探針。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質中，形成聚合物（J-aggregates），可產生紅色熒光（590 nm）；膜電位低于120 mV時，JC-1為單體，發出綠光（540 nm）。常用紅、綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變，可輕易檢測到細胞膜電位的下降；同時，也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉變，作為細胞凋亡早期的一個檢測指標。該方法靈敏度高，重復性好，實際觀察時以常規觀察紅色熒光和綠色熒光的設置即可。Debnath等[10]采用JC-1來檢驗chitosan水凝膠里培養的脂肪細胞的增殖分化潛力和活性。

2.4 溴-脫氧尿嘧啶摻入法（BrdU incorporation assay）

5′-溴-脫氧尿嘧啶（5′-bromo-deoxyuridine，BrdU）與胸腺嘧啶結構相似，其特點是胸腺嘧啶Ⅲ期嘧啶環與5位C連結的甲基被Br代替，在DNA合成過程中能與胸腺嘧啶一樣摻入其中，固定通透后，通過檢測BrdU標記的細胞能定性、定量地反應細胞的增殖狀態。Liang等[11]報道，進行增殖能力試驗時，由于BrdU可從大量活的但不增殖（如在G0期）的細胞中選擇性地測定增殖細胞，因此靈敏度比只能測活細胞總數增加的MTT法高，但如果是測活性，用MTT法更合適。有些藥物會抑制DNA合成，而使BrdU檢測增殖能力產生增殖細胞數減少和DNA抑制的雙重影響，從而產生部分假陽性。

3 細胞酶檢測

3.1 乳酸脫氫酶（LDH）釋放法

LDH正常時不能通過細胞膜，當細胞損傷或死亡時，可釋放到細胞外，使培養基內乳酸脫氫酶濃度增高。因此，細胞培養液中LDH活性與細胞死亡數目成正比，用比色法測定并與靶細胞對照孔LDH活性比較，可計算效應細胞對靶細胞的殺傷率，也可以計算細胞生存率。本法操作簡便快捷、靈敏度高，敏感性、客觀性、實際成本及測定速度都高于化學染色法和MTT法，并且自然釋放率低[12]。但是，培養基、pH值、溫度及底物顯色劑和終止劑等，都會影響檢測結果，實際操作很難掌握[13]。

3.2 甘油-3-磷酸脫氫酶的同工酶檢測（GAPDH）

利用合成的兒茶酚胺（異丙腎上腺素）可激活β-腎上腺素受體。這一過程可激活腺苷酸環化酶，將ATP轉換為cAMP。之后，cAMP通過激素敏感性脂肪酶，激活三酸甘油酯的水解過程，脂解作用可通過測定吸收峰在570 nm處的比色產物而確定，該吸收量與所含的甘油量成正比。Ferguson等[14]應用此法，檢測通過LipiVage system取得的自體脂肪標本的細胞內酶活性。雖然這是一種具有脂肪特異性的檢測法，但從受損細胞分離出來的細胞外G3PDH也能被檢測到，進而影響結果的準確性。

4 細胞凋亡標記物檢測

4.1 FITC Annexin V

在死細胞里，細胞膜phospholi822pid phosphatidylserine（PS）是從內側細胞質到外側細胞質分離出來的。Annexin V是Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，與PS密切相關，能和細胞膜PS結合；包含FITC的Annexin V能和熒光素結合。FITC Annexin V和PS密切相關，能和熒光素結合，從而可以把有利證據提供給流式細胞檢測分析。比如，活細胞對FITC Annexin V和PI均陰性，晚期凋亡細胞對FITC Annexin V和PI均陽性。Charles-de-Sá L等[15]應用此法，檢測抽脂時負壓大小、儀器種類、噴嘴直徑對脂肪細胞活性的影響，但其結果無明顯差異。正常細胞和早期凋亡細胞的細胞膜是完整的。Propidium iodide（PI）在凋亡晚期的細胞和死細胞中能夠透過細胞膜與細胞核結合呈現紅色，因此將Annexin V與PI聯合使用，可以同時檢測活細胞、早期凋亡細胞和壞死細胞。此法靈敏度高、重復性好、使用方便，但只適用于實驗，不適用于臨床檢測。細胞類型、細胞膜上PS的密度、發生凋亡時PS翻轉的比例、誘導細胞凋亡的方法、所用試劑、誘導凋亡的時間等，都會影響實驗結果，難以掌握并實際運用。

綜上所述，多種檢測技術的相繼出現，彌補了舊方法的缺點，提高了檢測結果。但準確度、靈敏度、費用或技術難度等，還是存在種種問題。相信隨著實驗技術和相關學科的不斷進步，將會有更經濟、有效的檢測方法出現，從而解決上述問題。

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Research Progress of Lipocyte Viability Assay

BAE Jinhong,LI Qingfeng.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China. Corresponding author:LI Qingfeng(E-mail:dr.liqingfeng@yahoo.com).

Lipocyte viability;Assay;Specificity

R622

B

1673－0364（2016）06－0388－03

2016年7月15日；

2016年8月25日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.06.017

200011上海市上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院整復外科。

李青峰（E-mail：dr.liqingfeng@yahoo.com）。

【Summary】Lipocyte viability assay is the standard for judgment of lipocyte's viability in vitro.It not only involves normal cell viability assay but also includes lipocyte-specific assessment.In this article,the principle,advantages,disadvantages and related applications of lipocyte viability assay were reviewed.