不明原因復發性自然流產患者蛻膜組織中miR-21和miR-31的表達及其與FOXP3的相關性研究

作者單位：510080 廣州，中山大學附屬第一醫院婦產科

不明原因復發性自然流產患者蛻膜組織中miR-21和miR-31的表達及其與FOXP3的相關性研究

方利元李珠玉李銀廣李婕侯文匯游澤山

【摘要】目的研究微小核糖核酸-21(miR-21)、miR-31和叉頭樣轉錄因子P3(FOXP3)在不明原因復發性自然流產(URSA)患者蛻膜中的表達情況，探討miR-21、miR-31與FOXP3之間的相關性。方法運用實時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡法測定miR-21、miR-31及FOXP3在URSA患者及正常對照組蛻膜組織中的表達情況，并分析miR-21、miR-31的表達與FOXP3表達的相關性。 結果FOXP3、miR-21在URSA組中的表達均明顯低于正常對照組(P均<0.05)，而miR-31在URSA組中的表達高于對照組(P>0.05)。蛻膜組織中miR-21，miR-31的表達與FOXP3的表達相關(P均<0.05)，其中miR-21與FOXP3表達呈正相關，而miR-31與FOXP3表達呈負相關。結論蛻膜組織中miR-21和miR-31的表達異常，可能通過下調FOXP3基因的表達而引起母體免疫耐受機制紊亂，從而導致URSA的發生。

【關鍵詞】不明原因復發性自然流產；微小核糖核酸-21；微小核糖核酸-31；叉頭樣轉錄因子P3

DOI：10.3969/g.issn.0253-9802.2015.02.003

基金項目：廣東省自然科學基金(S2013010015403)

通訊作者，游澤山，E-mail: youzeshan888@21cn.com

收稿日期：(2014-12-17)

Expression of miR-21 and miR-31 and correlation with FOXP3 expression in patients with unexplained recurrent spontaneous abortionFangLiyuan，LiZhuyu，LiYinguang，LiJie，HouWenhui，YouZeshan.DepartmentofObstetricsandGynecology,theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-SenUniversity,Guangzhou510080,China

Correspondingauthor，YouZeshan,E-mail:youzeshan888@21cn.com

Abstract【】ObjectiveTo investigate the expression of microRNA-21 (miR-21), miR-31 and forkhead box P3 (FOXP3) and analyze the correlation between miR-21 and miR-31, and FOXP3 in patients diagnosed with unexplained recurrent spontaneous abortion (URSA). MethodsThe expression levels of miR-21, miR-31 and FOXP3 in the decidua of URSA patients and healthy controls were detected by real-time qPCR and western blot. The correlation between miR-21/miR-31 and FOXP3 expression was analyzed. ResultsThe expression levels of FOXP3 and miR-21 in the URSA patients were significantly lower than those in the control group (both P<0.05), whereas the expression of miR-31 in the URSA group was significantly higher than that in the control group. The expression of miR-21 in the decidua tissue was positively correlated with the expression of FOXP3, whereas the expression of miR-31 was negatively associated with FOXP3 expression (both P<0.05). ConclusionAbnormal expression of miR-21 and miR-31 in the decidua probably causes disorder of maternal immune tolerance mechanism by down-regulating the expression of FOXP3, thereby leading to the incidence of URSA.

【Key words】Unexplained recurrent spontaneous abortion; MicroRNA-21; MicroRNA-31;

Forkhead box P3

自然流產是妊娠的常見并發癥，發生率約為10%~15%。連續與同一性伴侶發生2次或2次以上的自然流產為復發性自然流產(RSA) ，其中有40%~50%的RSA患者病因不明，稱為不明原因復發性自然流產(URSA)。目前的研究認為，部分URSA為同種免疫性疾病， CD4+CD25+T調節細胞(Treg)功能紊亂可導致該類疾病的發生，類似的有風濕性關節炎、SLE等[1-2]。Treg的細胞增殖及功能發揮均依賴叉頭樣轉錄因子P3(FOXP3)。研究發現，微小RNA(miRNA)不僅與腫瘤關系密切，在免疫性疾病中也起到重要作用。多種自身免疫性疾病中均檢測到miRNA-21(miR-21)或miR-31水平異常，并伴FOXP3表達改變[3-4]。在URSA患者中是否存在這種現象，筆者尚未見文獻報道。為此，本研究檢測了miR-21、miR-31及FOXP3在URSA蛻膜組織中的表達情況，并分析miR-21、miR-31的水平與FOXP3表達的相關性，探討在妊娠這種特殊免疫狀態下，miR-21和miR-31的改變能否對FOXP3基因表達形成調控，進而導致RSA的發生，現報告如下。

材料與方法

一、標本來源

70例絨毛及蛻膜組織取自2012年9月至2014年 6月在中山大學附屬第一醫院及東院進行清宮的女性患者。其中RSA患者44 例，正常對照組26例。 URSA組的納入標準為：年齡 24~35歲，既往至少有過1次自然流產史(且與本次連續)，夫妻雙方染色體核型正常，抗心磷脂抗體陰性，風濕組合正常，甲狀腺功能及抗甲狀腺自身抗體正常，無生殖器解剖結構異常及生殖道感染，男方精液常規正常或經治療后正常；本次妊娠出現難免流產或B超提示胚胎停止發育，胎齡6~12周，絨毛染色體檢查正常。正常對照組為計劃外懷孕要求終止妊娠的女性，年齡 24~35歲，既往無自然流產史，已正常生育至少1胎，本次妊娠無陰道出血及腹痛，B超結果提示胚胎或胎兒發育正常，胎齡6~12周，絨毛染色體檢查正常。本研究獲得醫院倫理委員會批準，入選研究者均簽署知情同意書。

二、主要試劑

包括：AmnioMAXTM-C100 完全羊水培養基(Gibco，美國)，RNAiso Plus總RNA提取試劑(Takara，日本)，SYBR?PrimeScriptTMmiRNA 實時熒光定量PCR試劑盒(Takara，日本)，兔抗人FOXP3多克隆抗體(CST，美國)，辣根過氧化物酶偶聯的羊抗兔二抗(博士德公司，中國)，ECL顯色試劑盒(凱基生物，中國)，GAPDH為內參抗體(杭州賢至生物，中國)。

三、方法

1. 標本采集及基因測序

征得患者知情同意后，抽取外周血5 ml，負壓吸引出絨毛及蛻膜，洗凈，部分絨毛行細胞培養，取外周血(對照用)及剩余絨毛組織外送深圳華大基因公司進行染色體全基因組測序，蛻膜組織迅速放置液氮中凍存，并轉入-80℃冰箱保存。

2. 絨毛組織培養及染色體核型分析

無菌收集絨毛組織，挑選典型長絨毛枝剪碎，消化，血清終止，離心，所得沉淀物中加入AmnioMAXTM-C100完全羊水培養基，置培養箱中培養5~7 d，見4~5個梭形細胞克隆后傳代，待貼壁細胞達60%加秋水仙堿收獲。常規進行低滲、預固定、固定、滴片、G-顯帶及觀察。每個標本計數20個分裂相并分析3~5個核型。根據染色體核型及華大基因公司測序結果，剔除染色體異常的RSA。

3. miR-21、miR-31 mRNA表達水平的檢測

采用實時熒光定量PCR法。按照Takara說明書，提取蛻膜組織總RNA。用超微量分光光度計(NanoDrop2000，美國)測定吸光度(OD)值及RNA濃度。在PCR擴增儀(Bio-Rad，美國)上進行Poly(A)加尾及逆轉錄反應。miR-21、miR-31及內參U6正向引物根據文獻設計，由廣州吉格生物科技有限公司合成(表1)。取逆轉錄所得產物在iQ5 實時熒光定量PCR儀(Bio-Rad ，美國)上采用2步法PCR擴增反應。每個樣本重復3個復孔，U6作為內參。記錄各樣本熒光擴增曲線圖及熔解曲線圖，以及每條反應管中的Ct值，采用定量PCR中的2-△△Ct相對定量法計算相對表達量(RQ)，并將正常對照組的RQ定為1。

表1　miR-21、miR-31及內參

4. FOXP3蛋白表達水平的檢測

采用蛋白免疫印跡法。細胞裂解液提取蛻膜組織全蛋白。取10 μl蛋白溶液在酶標儀(THERMO，美國)上定量。配好分離膠和濃縮膠后上樣。電泳至標記物中目的條帶分子量已完全分開后轉膜。牛奶封閉，加一抗(1∶1 000)4℃搖床過夜，TBST緩沖液洗滌后二抗(1∶2 500)常溫孵育2 h。ECL顯色，膠片曝光壓片。利用Image J軟件對條帶進行灰度分析處理，用FOXP3蛋白的條帶與GAPDH條帶的灰度比作為樣本的表達強度。

四、統計學處理

結果

一、絨毛染色體檢查結果

44例RSA患者中，絨毛染色體正常28例(即URSA，占64%)，絨毛染色體異常16例(占36%)，其中包括染色體數目異常14例，染色體結構異常2例；染色體數目異常中以三體為主。16例染色體異常的RSA患者不納入研究。26例正常對照組中，染色體正常25例，1例染色體異常不納入研究。

二、URSA組與正常對照組孕婦年齡及胎齡的比較

URSA組孕婦流產2~6次，年齡(31.4±4.7)歲，行清宮術時胎齡(7.4±1.9)周；正常對照組孕婦年齡(30.0±4.7)歲，行人工流產術時胎齡(7.9±1.8)周，2組的孕婦年齡及胎齡比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。

三、URSA組與正常對照組中FOXP3蛋白表達強度比較

FOXP3在URSA組及對照組中均有表達，在URSA組中的表達低于正常對照組(圖1A)。2組FOXP3蛋白相對表達強度比較差異有統計學意義(t=49.06，P<0.001)(圖1B)。

圖1　URSA組與正常對照組蛻膜組織中FOXP3蛋白表達水平的檢測結果

A：URSA組(A)與正常對照組(B)的FOXP3、GAPDH的蛋白免疫印跡結果；B：2組蛻膜組織中的FOXP3/GAPDH灰度比

四、URSA組與正常對照組中miR-21、miR-31 mRNA表達水平比較

miR-21、miR-31及內參U6的PCR產物條帶均清晰、單一，擴增效率接近100%，熔解曲線為單一峰，可用2-△△Ct法分析實驗結果。miR-21在URSA組及正常對照組的蛻膜組織中均有表達，將正常對照組的miR-21 mRNA表達量設定為1，URSA組miR-21的RQ即為0.17，URSA組的miR-21 mRNA表達水平明顯低于正常對照組(t=84.62，P<0.001)，見圖2A。miR-31在2組的蛻膜組織中均有表達，將正常對照組的miR-31 mRNA表達量設定為1，URSA組miR-31的RQ為5.9，URSA組的miR-31 mRNA表達水平明顯高于正常對照組(t=499.6，P<0.001)，見圖2B。

圖2URSA組與正常對照組蛻膜組織中miR-21、miR-31 mRNA的RQ值比較

A：miR-21；B： miR-31

五、miR-21和miR-31 mRNA表達水平與 FOXP3蛋白表達強度的相關性分析

所有研究對象蛻膜組織中miR-21 mRNA表達水平與 FOXP3蛋白表達強度均呈正相關，而miR-31 mRNA表達水平與 FOXP3蛋白表達強度呈負相關，見表2。

表2　URSA組與正常對照組蛻膜組織中miR-21、 miR-31與 FOXP3的相關性分析

討論

自然流產病因復雜，常見的包括胚胎或夫妻的染色體異常、女方內分泌紊亂、生殖器解剖結構異常、感染等。隨著生殖免疫的發展，正常妊娠被認為是母體免疫系統耐受胚胎這一半同種異體移植物。其中CD4+CD25+Treg起到重要作用。該細胞具有免疫抑制功能，妊娠期能使母體免疫系統耐受胚胎的父系基因表達的同種異體抗原。研究發現，正常妊娠時大量CD4+CD25+Treg聚集在蛻膜面，而URSA患者蛻膜組織中CD4+CD25+Treg明顯減少[5]。CD4+CD25+Treg抑制傳統T細胞產生細胞因子，抑制自然殺傷細胞的毒性作用，阻止輔助性T細胞2(Th2)的分化，使Th1/Th2平衡偏向Th1，最終誘導機體的免疫耐受[6-7]。FOXP3是CD4+CD25+Treg的特征性標志物，Treg在免疫方面的作用主要由FOXP3體現。FOXP3表達過低，引起CD4+CD25+Treg免疫抑制功能減弱或喪失，進而引起母體對胚胎的排斥，引發自然流產，這是URSA可能的發病機制之一。本課題組前期研究發現，FOXP3基因的多態性可能通過改變FOXP3的功能或表達而引起URSA[8]。本研究中，URSA組蛻膜組織中FOXP3的表達明顯低于正常對照組，也再次證明了上述發病機制的可能性。

雖然FOXP3表達下調可能會引起URSA的發生，但其具體機制仍不明確。miRNA是非編碼小分子RNA，通過與靶mRNA 3’-非翻譯區結合，使其降解或轉錄后翻譯抑制，從而實現對靶基因表達的調控。近年研究發現，miRNA不僅參與腫瘤的發生、發展，其在多種免疫性疾病中也起到關鍵作用[9-11]。類風濕性關節炎患者外周血單個核細胞中miR-21的表達水平明顯低于正常對照組[12]。在脂瀉病患者中可檢測到miR-31表達的下調而FOXP3表達上調[4]。川崎病兒童外周血中miR-21低表達而miR-31高表達，并伴有FOXP3表達的減少[13]。這類參與自身免疫性疾病過程的miRNA稱為“免疫-miRNA”，其能調控T細胞增殖、分化及凋亡等過程[14]。上述研究均提示miR-21及miR-31與Treg的免疫功能關系密切。Rouas等[15]發現，正常人臍帶血T細胞中的miR-21可間接上調FOXP3表達，而miR-31可能通過與FOXP3 mRNA 3’-非翻譯區潛在結合，從而下調FOXP3基因的表達。前述幾種免疫性疾病均有miR-21或miR-31表達水平的異常，但URSA作為一種特殊的自身免疫性疾病，該類患者體內“免疫-miRNA”的表達情況尚未見文獻報道。本研究顯示，URSA患者蛻膜組織中存在miR-21表達的明顯下調、miR-31表達的明顯上調，且分別與FOXP3的表達呈正相關、負相關。由于本研究只是一個初步驗證，暫未深入研究miR-21及miR-31具體調控FOXP3的機制，是否存在妊娠期某些特殊調節的方式或特殊因子參與，有待進一步研究。

總之，URSA蛻膜組織中FOXP3的表達下調，可能與miR-21及miR-31的異常調節作用有關。本研究為URSA的發生機制提供了新的視角，為臨床上URSA患者的治療提供了新思路。

參考文獻

[1]Haque M, Fino K, Lei F, et al. Utilizing regulatory T cells against rheumatoid arthritis. Front Oncol,2014,4:209.

[2]Okamoto A, Fujio K, Okamura T, et al. Regulatory T-cell-associated cytokines in systemic lupus erythematosus. J Biomed Biotechnol,2011, 2011:463412.

[3]Pan W, Zhu S, Yuan M, et al. MicroRNA-21 and microRNA-148a contribute to DNA hypomethylation in lupus CD4+T cells by directly and indirectly targeting DNA methyltransferase 1. J Immunol, 2010,184:6773-6781.

[4]Magni S, Comani GB, Elli L, et al. miRNAs affect the expression of innate and adaptive immunity proteins in celiac disease. Am J Gastroenterol,2014,109:1662-1674.

[5]Sasaki Y, Sakai M, Miyazaki S, et al. Decidual and peripheral blood CD4+CD25+regulatory T cells in early pregnancy subjects and spontaneous abortion cases. Mol Hum Reprod, 2004, 10:347-353.

[6]Taams LS, Akbar AN. Peripheral generation and function of CD4+CD25+regulatory T cells. Curr Top Microbiol Immunol,2005,293:115-131.

[7]Zeng WP, Sollars VE, Belalcazar Adel P. Domain requirements for the diverse immune regulatory functions of foxp3. Mol Immunol,2011,48:1932-1939.

[8]吳再歸，游澤山，張彩，等.Foxp3基因多態性與原因不明復發性自然流產易感性的關系. 中華婦產科雜志,2011,46:763-768.

[9]Lei SL, Zhao H, Yao HL, et al. Regulatory roles of microRNA-708 and microRNA-31 in proliferation, apoptosis and invasion of colorectal cancer cells. Oncol Lett,2014,8:1768-1774.

[10]Lu WC, Kao SY, Yang CC, et al. EGF up-regulates miR-31 through the C/EBPbeta signal cascade in oral carcinoma. PLoS One,2014,9:e108049.

[11]Wang Z, Cai Q, Jiang Z, et al. Prognostic role of MicroRNA-21 in gastric cancer: a meta-analysis. Med Sci Monit,2014,20:1668-1674.

[12]Dong L, Wang X, Tan J, et al. Decreased expression of microRNA-21 correlates with the imbalance of Th17 and Treg cells in patients with rheumatoid arthritis. J Cell Mol Med,2014,18:2213-2224.

[13]Ni FF, Li CR, Li Q, et al. Regulatory T cell microRNA expression changes in children with acute Kawasaki disease. Clin Exp Immunol,2014,178:384-393.

[14]Kroesen BJ, Teteloshvili N, Smigielska-Czepiel K, et al. Immuno-miRs: critical regulators of T-cell development, function and ageing. Immunology,2015,144:1-10.

[15]Rouas R, Fayyad-Kazan H, El Zein N, et al. Human natural Treg microRNA signature: role of microRNA-31 and microRNA-21 in FOXP3 expression. Eur J Immunol,2009,39:1608-1618.

(本文編輯：林燕薇)

基礎研究論著