外周血LUNX mRNA與圍手術期肺癌微轉移相關性的臨床研究

作者單位：529000 江門，江門市中心醫院胸外科(林志潮，黃文海，葉敏，盧珠明，伍碩允)，檢驗科(伍金華)；518000 深圳，深圳市第二人民醫院胸外科(池惠良)

外周血LUNX mRNA與圍手術期肺癌微轉移相關性的臨床研究

林志潮池惠良伍金華黃文海葉敏盧珠明伍碩允

【摘要】目的分析非小細胞肺癌(NSCLC)患者圍手術期外周血中肺組織特異性基因(LUNX)mRNA的表達與肺癌微轉移的相關性，并探討肺癌根治術中肺血管結扎順序對LUNX mRNA表達的影響。方法120例臨床可行肺癌根治術的Ⅰ、Ⅱ期和部分ⅢA期(T3N1～2M0)NSCLC患者被納入實驗組，所有患者術前檢查均明確無遠處轉移病灶。術前將患者隨機分為靜脈組(先結扎肺靜脈)及動脈組(先結扎肺動脈)各60例，分別于術前、術中、術后第7日抽取外周血，采用逆轉錄PCR(RT-PCR)檢測其外周血LUNX mRNA的表達情況。另選取60名健康體檢者及30例肺部良性疾病需行肺葉切除患者為對照組，同法檢測外周血LUNX mRNA的表達情況。結果實驗組術前、術中、術后LUNX mRNA表達陽性率分別為47%、61%及20%。靜脈組與動脈組術前LUNX mRNA表達陽性率比較差異無統計學意義(P>0.05)；動脈組術中LUNX mRNA表達陽性率明顯較術前高(P=0.017)；術后2組LUNX mRNA表達陽性率均較術前低(P<0.001、P=0.022)。2組內術前不同TNM分期之間LUNX mRNA表達陽性率比較差異均有統計學意義(P=0.015、P=0.004)，LUNX mRNA表達陽性率均隨分期上升而升高。術前2組間不同TNM分期LUNX mRNA表達陽性率比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；術中動脈組不同TNM分期的LUNX mRNA表達陽性率均高于靜脈組，但比較差異無統計學意義(P均>0.05)；術后，在Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者中，2組LUNX mRNA表達陽性率比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，而在ⅢA期患者中，動脈組術后LUNX mRNA表達陽性率顯著高于靜脈組(P=0.011)。對照組均無LUNX mRNA表達陽性者。結論手術治療有助于抑制肺癌微轉移，但仍有部分患者有肺癌微轉移可能，仍存在術后癌灶復發、轉移的風險；肺癌根治術中應采用先結扎肺靜脈的順序；LUNX mRNA的表達也與TNM分期有關。

【關鍵詞】肺組織特異性基因；非小細胞肺癌；微轉移；肺血管結扎，順序

DOI:10.3969/g.issn.0253-9802.2015.02.006

基金項目：廣東省醫學科研基金(A2011662)

通訊作者，伍碩允，E-mail：wu666-666@163.com

收稿日期：(2014-09-28)

Relationship of LUNX mRNA level in peripheral blood and micro-metastasis of lung cancer during perioperative periodLinZhichao,ChiHuiliang,WuJinhua,HuangWenhai,YeMin,LuZhuming,WuShuoyun.DepartmentofThoracicSurgery,theCentralHospitalofJiangmenCity,Jiangmen529000,China

Correspondingauthor,WuShuoyun,E-mail:wu666-666@163.com

Abstract【】ObjectiveTo explore the relationship of lung-specific X protein (LUNX)evel in hip mRNA level in peripheral blood and micro-metastasis of lung cancer during perioperative period in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) and assess the influence of sequence of pulmonary vessel ligation upon LUNX mRNA expression during radical resection of pulmonary carcinoma. MethodsA total of 120 patients with TNM stage Ⅰ, Ⅱ and ⅢA(T3N1～2M0) NSCLC suitable for undergoing radical resection of pulmonary carcinoma were allocated into the experimental group. All patients had no distant metastasis confirmed by preoperative examination. Prior to surgery, all patients were randomly divided into the vein (they were first given pulmonary venous ligation, n=60) and artery groups (they were first given pulmonary arterial ligation, n=60). Peripheral blood sample was collected before, during and at 7 d after operation. The expression level of LUNX mRNA in peripheral blood was detected by RT-PCR. Another 60 healthy subjects and 30 individuals with benign lung diseases requiring lobectomy were allocated into the control group,the expression level of LUNX mRNA in peripheral blood was equally measured. ResultsThe positive rate of LUNX mRNA expression in the experimental group was 47%, 61% and 20% before, during and after surgery, respectively. Preoperative positive rate of LUNX mRNA expression did not significantly differ between the vein and artery groups (P>0.05). Intraoperative positive rate of LUNX mRNA expression was significantly higher compared with preoperative level in the artery group (P=0.017). Postoperative positive rate of LUNX mRNA expression was significantly lower than preoperative positive rate in both groups (P<0.001, P=0.022). In two groups, preoperative positive rates of LUNX mRNA expression significantly differed among different TNM stages (P=0.015, P=0.004). The positive rate of LUNX mRNA expression was elevated along with TNM stage. Preoperative positive rates of LUNX mRNA expression among different TNM stages did not significantly differ between two groups (all P>0.05). Intraoperative positive rates of LUNX mRNA expression among different TNM stages in the artery group was higher compared with that in the vein group with no statistical significance (all P>0.05). For patients diagnosed with stage Ⅰ and Ⅱ lung cancer, postoperative positive rates of LUNX mRNA expression did not significantly differ between two groups (both P>0.05), whereas postoperative positive rate of LUNX mRNA expression in the artery group was significantly higher than that in the vein group for those with TNM Sstage ⅢA lung cancer (P=0.011). No subjects in the control group expressed LUNX mRNA. ConclusionsSurgical treatment contributes to inhibiting micro-metastasis of lung cancer. However, partial patients still have the possibility of lung cancer micro-metastasis, lesion recurrence and metastasis still exists. Pulmonary vein should be ligated before pulmonary artery in radical resection of NSCLC. The expression of LUNX mRNA is equally correlated with TNM stage.

【Key words】Lung-specific X protein; Non-small cell lung cancer; Micro-metastasis;

Pulmonary vessel ligation，sequence

有報道示，肺癌已成為我國發病率和病死率最高的惡性腫瘤[1]。非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%～85%，手術是治療Ⅰ～ⅢA期NSCLC患者主要的手段。但目前肺癌的治療效果尚不盡如人意，治療失敗的主要原因是術后復發和轉移。即使是早期發現并行肺癌根治術的Ⅰ期NSCLC患者，仍有25%～30%最終會發生局部復發或遠處轉移[2-3]。由于肺癌早期即可存在常規臨床方法檢測不到的全身微轉移，相同TNM分期的患者預后也不盡相同，對肺癌患者微轉移(mircrometastasis)的研究有助于我們更好地探討肺癌的分期、預后以及治療模式[4]。按照腫瘤外科手術原則，惡性腫瘤手術中應先結扎腫瘤的輸出靜脈，以減少術中腫瘤細胞的擴散，但在肺癌根治術的臨床實踐中，肺動、靜脈的結扎順序尚無統一原則。手術操作是否會促進腫瘤細胞入血，尤其是肺葉切除時動、靜脈的結扎順序是否影響腫瘤細胞的播散仍不清楚。

肺組織特異性基因(LUNX)是由Iwao等[5]發現的，對檢測肺癌的微轉移有重要意義。筆者通過逆轉錄PCR(RT-PCR)檢測NSCLC患者術前、術中以及術后外周血LUNX mRNA的表達來探討NSCLC的微轉移情況，也探討了手術操作是否會促進腫瘤細胞入血，手術治療是否可以降低肺癌患者術后遠處轉移的風險，并通過對比先結扎肺靜脈與先結扎肺動脈對LUNX mRNA表達的影響，探討手術過程中應遵循的操作順序。

對象與方法

一、研究對象

按以下標準篩選2012年9月至2014年3月在江門市中心醫院胸外科住院的NSCLC患者：年齡≤70歲；無肺癌根治術的手術禁忌證；術前胸部CT提示為臨床可手術的TNM分期為Ⅰ、Ⅱ或ⅢA期(T3N1～2M0)的NSCLC；術前常規檢查包括電子支氣管鏡，腦部、胸部CT，肝、膽、脾、胰、腎上腺B超以及骨掃描等顯示無遠處轉移病灶。符合上述標準的120例患者被納入實驗組，其中男69例、女51例，年齡26～69歲、中位年齡53歲，病程5～180 d、中位病程45 d，吸煙者65例、非吸煙者55例，術前通過SAS軟件把實驗組隨機分為靜脈組(先結扎肺靜脈)及動脈組(先結扎肺動脈)各60例，2組一般情況具可比性(表1)。2組術前均未行化學及放射治療，手術操作均由同一手術組及同一醫師主刀完成。所有NSCLC患者行肺癌根治術時均嚴格遵守外科無瘤原則，均經病理學檢查明確NSCLC診斷。另將同期在我院行健康體檢的60名志愿者以及因肺部良性疾病需行肺葉切除的30例患者設為對照組，其中男53例、女37例，年齡25～66歲、中位年齡50歲；健康體檢者均無全身各部位腫瘤史，肺部良性疾病患者中支氣管擴張11例、結核8例、炎性假瘤5例、中葉綜合征2例、肺隔離征1例、真菌感染1例。實驗組與對照組的年齡、性別比例比較差異無統計學意義(P>0.05)。所有入選本研究者均對研究知情同意。

表1　靜脈組及動脈組NSCLC患者

二、方法

1. 試劑和引物設計

對所有入選者行RT-PCR法擴增目的基因LUNX及內參照基因β-actin。引物均由上海SANGON公司合成。參照Iwao等[5]設計的特異性引物序列，LUNX上游引物：5′-TCATTGTCTTCTACGGGCTGTT-3′；下游引物：5′-CTTGGAGCTTTATGCCGA-GAG-3′,擴增片段長度為402 bp。根據β-actin基因序列設計內參照上下游引物序列分別為，上游引物：5′-CTCATTGTCTTCTACGGGCTGTTAG-3′；下游引物：5′-CTTTATGCCGAGAGGGATGGT-3′，擴增的cDNA片段長度為155 bp。Trizol試劑盒由Invitrogen公司提供，One Step RT-PCR試劑盒及DL1000 DNA Marker由Taraka公司提供。

2. 儀器和設備

離心機購自德國Eppendorf公司；PCR儀購自美國ABI公司；凝膠電泳儀及成像系統購自美國Bio-rad公司。

3. 實驗方法

總RNA提取和鑒定：實驗組分別于術前、術中(明確胸部切口縫合關胸后)、術后第7日抽取外周靜脈血5 ml，予乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。按照Trizol試劑盒說明書提取外周血總RNA，行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定及紫外分光測定。1%瓊脂糖凝膠電泳可見清晰的28S和18S條帶,紫外分光光度儀測定總RNA的OD260/OD280在1.6～1.8之間。對照組中健康體檢者在體檢時常規抽取外周靜脈血，肺部良性疾病患者于術前、術中、術后第7日分別抽取外周靜脈血5 ml，提取、鑒定總RNA等操作與實驗組相同。

一步法RT-PCR：每份標本均擴增LUNX及β-actin。按照PrimeScript One Step RT-PCR Kit說明書進行。總反應體系50 μl：PrimeScript One Step Enzyme Mix 2 μl，2×One Step Buffer 25 μl，LUNX及β-actin上、下游引物各1 μl，提取總RNA 10 μl，RNase Free dH20 9 μl。RT-PCR參數設定：50℃逆轉錄30 min，94℃逆轉錄酶滅活和預變性2 min。94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環40次。最后得到循環產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果，若出現LUNX mRNA特異的402 bp條帶，則為LUNX mRNA表達陽性[6]。

三、統計學處理

應用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，定性資料比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，其中組內手術前、后比較采用配對χ2檢驗，組間比較采用獨立樣本的χ2檢驗或Fisher確切概率法，定量資料的比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結果

一、實驗組中靜脈組與動脈組手術情況比較

所有NSCLC患者均順利完成手術。靜脈組術中出血量為(86.47±0.94) ml，動脈組為(90.72 ±1.16)ml，2組比較差異無統計學意義(t=0.685、P=0.531)。2組均有1例術后發生肺不張，靜脈組2例、動脈組1例于術后發生細支氣管胸膜瘺，均不超過1周，均經留置胸腔閉式引流等對癥治療后好轉，其余病例未見明顯并發癥。120例均順利出院，無圍手術期死亡者，住院時間(11.5±1.6) d。

二、實驗組LUNX mRNA表達情況

實驗組術前、術中及術后LUNX mRNA表達陽性例數分別為56、73及24例，陽性率分別為47%、61%及20%；各TNM分期陽性率如下，Ⅰ期：術前23%、術中43%、術后8%，Ⅱ期：術前46%、術中63%、術后20%，ⅢA期：術前72%、術中78%、術后33%。靜脈組與動脈組具體情況如下。

1. 靜脈組與動脈組LUNX mRNA表達陽性情況

靜脈組術前、術中及術后LUNX mRNA表達陽性例數分別為29、33及9例，陽性率分別為48%、55%及15%；各TNM分期陽性率如下，Ⅰ期：術前24%、術中29%、術后6%，Ⅱ期：術前45%、術中50%、術后20%，ⅢA期：術前70%、術中74%、術后17%。動脈組術前、術中及術后LUNX mRNA表達陽性例數分別為27、40及15例，陽性率分別為45%、67%及25%；各TNM分期陽性率如下，Ⅰ期：術前22%、術中52%、術后10%，Ⅱ期：術前48%、術中76%、術后19%，ⅢA期：術前75%、術中94%、術后56%。

2. 靜脈組與動脈組手術前、中、后LUNX mRNA表達陽性率的比較結果

2組術前LUNX mRNA表達陽性率比較差異無統計學意義(χ2=0.134，P=0.714)。2組術中LUNX mRNA表達陽性率均較術前升高，其中靜脈組術中LUNX mRNA表達陽性率雖然比術前升高，但比較差異無統計學意義(χ2=0.534，P=0.465) ，而動脈組術中LUNX mRNA表達陽性率明顯比術前高，比較差異有統計學意義(χ2=5.711，P=0.017)。術后2組LUNX mRNA表達陽性率均較術前下降，比較差異有統計學意義(靜脈組χ2=15.404、P<0.001，動脈組χ2=5.275、P=0.022)。

3. 靜脈組與動脈組不同TNM分期LUNX mRNA表達陽性率的比較結果

2組內術前不同TNM分期之間LUNX mRNA表達陽性率比較差異均有統計學意義(靜脈組χ2=8.429、P=0.015，動脈組χ2=10.904、P=0.004)，LUNX mRNA陽性率均隨分期上升而升高。

術前，2組間不同TNM分期LUNX mRNA表達陽性率比較差異均無統計學意義(Ⅰ期Fisher確切概率法P=1.000，Ⅱ期χ2=0.028、P=0.867，ⅢA期Fisher確切概率法P=1.000)。術中，動脈組不同TNM分期LUNX mRNA表達陽性率均高于靜脈組，但比較差異無統計學意義(Ⅰ期χ2=2.072、P=0.150，Ⅱ期χ2=3.029、P=0.082，ⅢA期Fisher確切概率法P=0.206)。術后，在Ⅰ、Ⅱ期肺癌患者中，2組LUNX mRNA表達陽性率比較差異均無統計學意義(Fisher確切概率法均為P=1.000)；而在ⅢA期患者中，動脈組LUNX mRNA表達陽性率顯著高于靜脈組(χ2=6.214，P=0.011)。

實驗組的擴增情況見圖1A、B。

三、對照組LUNX mRNA表達情況

對照組健康體檢者60例及肺部良性疾病需行肺葉切除者30例術前、術中、術后第7日LUNX mRNA均為陰性。對照組的擴增情況見圖1C。

圖1　實驗組與對照組1%瓊脂糖凝膠電泳圖

A：實驗組凝膠電泳圖示例1，M泳道為DNA marker，1、2、3泳道分別為術前、術中、術后外周血總RNA擴增情況，均擴增出β-actin，該患者術前、術中LUNX mRNA表達陽性(402 bp)，術后LUNX mRNA表達陰性；B：實驗組凝膠電泳圖示例2，M泳道為DNA marker，1、2、3泳道分別為術前、術中、術后外周血總RNA擴增情況，均擴增出β-actin，該患者僅術中LUNX mRNA表達陽性(402 bp)，術前、術后LUNX mRNA表達均陰性；C:對照組中肺部良性疾病行肺葉切除者電泳圖，M泳道為DNA marker，1、2、3泳道分別為術前、術中、術后外周血總RNA擴增情況，均擴增出β-actin(155 bp)，但均未擴增出LUNX mRNA(402 bp)

討論

腫瘤的微轉移是指惡性腫瘤在發展過程中，癌細胞播散并存活在外周血、淋巴結、骨髓或各組織器官中，但尚未形成顯性轉移灶，轉移部位也無任何臨床表現，采用影像學和常規病理學檢查方法難以檢測到的微量轉移，需要通過分子生物學的技術予以診斷[7]。腫瘤微轉移對腫瘤診斷、分期、治療及預后判斷有重要意義[8]。TNM分期法的主要依據是臨床影像學和臨床病理學資料，而未結合腫瘤微轉移的生物學特征。隨著分子生物學的發展，對肺癌微轉移的研究不斷深入，肺癌的分子分期逐漸被重視。肺癌的分子分期是指采用多種先進的分子生物學診斷技術檢測肺癌患者的外周血、淋巴結、骨髓及胸腔積液等組織，從中發現臨床影像學或常規病理學檢查無法檢測到的微轉移，進而從基因或分子水平來診斷肺癌的轉移，并根據檢測到微轉移的部位和肺癌的國際分期標準，最終對肺癌患者重新進行分期[9]。

LUNX mRNA自被發現以來，其在診斷肺癌微轉移中的意義越來越受人們關注。LUNX定位于20p11.1-q12，分子量為26.7 kDa，它能在所有的正常肺組織中特異性表達，并會在NSCLC中過度表達[6]。研究表明LUNX mRNA在NSCLC中的表達特異性增高，如果在肺癌患者循環血中檢測出LUNX mRNA，就預示著其有肺癌微轉移的可能[10-11]。LUNX mRNA的檢測對患者預后判斷亦有重要參考價值，諸多學者發現LUNX表達陽性是患者預后不良的獨立危險因素[12-14]。

本研究中實驗組術后第7日LUNX mRNA的表達率比術前低，提示肺癌根治術是治療早期NSCLC的有效手段，腫瘤被切除后腫瘤負荷降低，手術可以降低肺癌患者術后遠處轉移的可能。然而，Ⅱ期和ⅢA期患者術后第7日LUNX mRNA的陽性表達率為20%和33%，即使是Ⅰ期的患者，術后第7日仍有8% LUNX mRNA表達為陽性，提示其仍有術后癌灶復發與轉移的風險。因此，對于術后LUNX mRNA表達陽性的Ⅰ期患者，可考慮上調其臨床分期，對其進行更積極的治療和干預。目前，術后是否需予Ⅰ期患者輔助治療的問題仍存在爭議，可通過檢測患者外周血中LUNX mRNA的表達，為患者提供個體化治療的依據；而術后LUNX mRNA表達轉陰的患者，亦可繼續檢測其外周血LUNX mRNA的表達來監測腫瘤是否有微轉移[12-14]。

手術是早期肺癌最重要的治療手段，手術過程中減少對腫瘤組織的擠壓能減少腫瘤細胞進入血液的機會[15]。無瘤原則中規定手術時需先結扎阻斷輸出靜脈，然后結扎處理動脈。然而目前胸外科醫師在行肺葉切除時，肺動、靜脈的結扎順序尚未完全統一，原因可能是較多胸外科醫師擔心若先結扎肺靜脈、后結扎肺動脈，可能會造成肺淤血，導致術中出血增加，加大手術難度。張位星等[16]在肺癌根治術中按先結扎肺靜脈或先結扎肺動脈將患者分為2組，通過輸血量初步估計患者術中失血情況，發現2組的輸血量相近。本研究中靜脈組與動脈組失血量比較差異無統計學意義，在手術過程中保持細致、謹慎和輕柔的操作是我們的經驗。肺血管結扎順序對肺癌微轉移有重要影響，Kurusu等[17]報道，肺葉切除時肺動、靜脈結扎順序可能會影響癌細胞入血的數量。顧愷時[18]也指出，按照腫瘤外科的手術要求，處理肺門時應先處理肺靜脈，以減少癌細胞轉移的可能性，但目前該觀點仍缺乏循證醫學證據。亦有少數相關文獻報道肺癌手術中肺動、靜脈結扎順序對肺癌預后無影響[19]。本研究結果示，靜脈組與動脈組術中LUNX mRNA表達的陽性率均高于術前，其中靜脈組術中與術前陽性率比較差異無統計學意義，而動脈的術中與術前陽性率比較差異則有統計學意義(P=0.017)，這提示先結扎肺動脈者術中腫瘤細胞脫落到外周血的機率較術前明顯升高，會增加肺癌微轉移發生的風險，而先結扎肺靜脈者術中微轉移機率未顯著升高，這與Song等[20]的研究結果一致。

對實驗組進行不同TNM分期的分層分析結果顯示，動脈組術中不同TNM分期者LUNX mRNA表達陽性率均高于靜脈組，但比較差異尚無統計學意義，推測可能與樣本量不夠有關，可通過進行大樣本的臨床試驗來提供更準確的數據。靜脈組與動脈組ⅢA期患者術后LUNX mRNA表達陽性率比較差異有統計學意義，提示先結扎動脈比先結扎靜脈的微轉移風險高，當然，這需要長期的隨訪研究證實；而在Ⅰ、Ⅱ期患者中，2組術后LUNX mRNA表達陽性率比較差異無統計學意義，這可能由于Ⅰ、Ⅱ期患者肺部原發腫瘤較小，無侵犯周圍組織，且手術操作時對腫瘤的擠壓較少，故肺動、靜脈結扎順序對腫瘤細胞脫落入血的實質性影響較小，這也需要行更多臨床研究進一步證實。

本研究的結果表明，通過檢測敏感反映NSCLC微轉移的特異性指標LUNX，可以明確肺癌根治術是治療早期肺癌的有效手段，有助于抑制肺癌微轉移，但仍有部分患者術后LUNX mRNA表達陽性，提示其有肺癌微轉移可能，仍存在術后癌灶復發、轉移的風險。另外，肺癌根治術中應采用先結扎肺靜脈的順序。TNM分期較低的患者術后LUNX mRNA的表達也較低，LUNX mRNA的表達也與TNM分期有關。

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(本文編輯：洪悅民)

臨床研究論著