適度酒精預適應對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷保護作用的研究

趙一龍，郭安臣，蘇芳，李巍巍，楊華俊，孫明，王擁軍1，2，3，，王群1，2，3，

缺血性卒中占卒中的60%～80%，具有高致殘、高致死的特點[1]。流行病學發現適量飲用紅葡萄酒可降低心腦血管疾病發病率[2]。前期研究發現：在全腦缺血再灌注模型中，適量酒精在再灌注24 h前灌胃保護了隨后的腦缺血再灌注誘導的遲發性神經元損傷[3]。故本研究提出以下假設：適度酒精預適應對局灶性腦缺血再灌注誘導的神經元損傷有保護作用。本實驗利用局灶性腦缺血再灌注模型，從整體和組織水平闡明適度酒精預適應對局灶性腦缺血再灌注損傷存在保護作用，為紅酒的適量飲用可產生腦預適應保護，預防缺血性卒中提供理論證據，并提出“外源性適量酒精預適應激活腦內源性保護機制”的概念。

1 對象與方法

1.1 研究對象和分組 采用雄性SD大鼠，體重320～350 g[北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2012-0001]。36只大鼠隨機分為假手術組、缺血/再灌注組和酒精預適應組，每組各12只。

缺血再灌注組和酒精預適應組大鼠采用線栓法制作右側大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，缺血2 h，再灌注24 h。

酒精預適應方法：酒精預適應組在局灶性腦缺血再灌注前24 h用95%酒精（批號41322，sigma）與0.3 ml無菌蒸餾水混合后在非麻醉狀態下直接進行灌胃，95%酒精體積（μl）計算為：[大鼠體重（g）×0.6]+0.3。其余兩組用同等體積的生理鹽水（批號11033042，天津藥業焦作有限公司）做同樣灌胃處理。每組各取8只大鼠在缺血再灌注后24 h進行神經功能評分，然后麻醉處死取腦，行氯化2，3，5-三苯基四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色，比較各組的腦梗死體積。

每組剩余的4只大鼠，在缺血再灌注后24 h進行小動物磁共振T2加權像（T2-weighted imaging，T2WI）序列掃描，觀察各組大鼠梗死體積的情況。然后將大鼠處死取腦，冷凍切片后，每只大鼠取第一軀體感覺皮質區的2張切片，1張用末端轉移酶介導的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸缺口末端標記（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated 2'-deoxyuridine 5'-triphosphate nick-end labeling，TUNEL）檢測其凋亡性細胞死亡情況，另一張用Fluoro-Jade B檢測其神經元退化變性情況。

1.2 缺血再灌注模型制作方法 用5%異氟烷（河北一品制藥有限公司，京藥制字H19980141）通過氣體麻醉機對動物行氣體麻醉，以仰臥位放置在37℃恒溫板上。采用線栓法制作右側MCAO模型[4]。具體方法為，在手術顯微鏡下經頸正中切口，暴露右側頸外動脈和頸內動脈。線栓經頸外動脈斷端進入頸內動脈，向內延伸約20 mm直到感到抵觸感，此時線栓的頭部越過大腦中動脈的起始端，并阻斷大腦中動脈的血流。腦缺血2 h后線栓被拔出至頸外動脈的斷端，再灌注24 h。假手術組線栓在頸外動脈斷端處被結扎，不再向頸內動脈延伸，其余手術過程與其他幾組相同。術后待大鼠清醒后，觀察大鼠是否有肢體屈曲或偏癱癥狀[5]。如果沒有，說明造模不成功。將造模失敗的大鼠去除，重新造模補充。

1.3 試驗方法

1.3.1 神經功能行為評分 在局灶性腦缺血再灌注后24 h，采用Chen等[6]使用的行為評分方法，對各組動物進行神經功能評分（表1）。

1.3.2 TTC染色及梗死體積測量 局灶性腦缺血再灌注后24 h，動物按400 mg/kg劑量腹腔注射10%水合三氯乙醛膠漿（北京天壇醫院制劑，京藥制字H20083287）麻醉后，斷頭處死。迅速取出腦組織，檢查并確定有無蛛網膜下腔出血。將每個腦組織切為2 mm厚的冠狀切片，共6片，在37℃水浴中與1%TTC（Sigma-Aldrich，美國）溶液避光孵育20 min，再于10%甲醛溶液中固定10 min。將TTC染色后的6張腦片照相后保存，以進行損傷區域的測量。采用圖像分析系統（HMIAS-2000，北京空海科技發展公司）計算未被TTC染色的區域，即腦缺血損傷區域。總梗死體積的計算方法為6張腦片未染色的面積總和乘以腦片厚度。

1.3.3 磁共振檢查 局灶性腦缺血再灌注后24 h，動物以10%水合氯醛麻醉，應用德國Bruker 7.0 T超高場實驗動物磁共振掃描儀進行頭部磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）的T2WI序列平掃。掃描參數：重復時間/回撥時間（repetition time/echo time，TR/TE）=3140/37 ms；層厚1.0 mm。用圖像處理軟件（matlab，MathWorks，美國）計算出各組動物的梗死體積。

1.3.4 TUNEL法檢測細胞凋亡 磁共振檢查后，將大鼠斷頭處死，迅速取出腦組織，以4%多聚甲醛固定，后經30%蔗糖溶液脫水，冷凍切片后用于TUNEL檢測和Fluoro-Jade B染色。

每只大鼠取第一軀體感覺皮質區的1張切片，使用原位細胞凋亡檢測試劑盒（No.11684817910，羅氏診斷產品有限公司，德國）進行分析。25 μm厚的冠狀切片在冰上經滲透液滲透后，在每個樣本上加入50 μl TUNEL反應混合液，37℃避光反應60 min。切片使用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復染后，熒光顯微鏡（DMI400B，Leica，德國）觀察。每張切片在梗死灶周邊區隨機選取5個高倍視野，每個高倍視野分別進行TUNEL陽性細胞和細胞核總數的計數，統計結果以每只大鼠的5個高倍視野TUNEL陽性細胞所占平均百分比進行分析。

表1 大鼠腦損傷后神經功能評分

1.3.5 Fluoro-Jade B染色檢測神經元退化變性 每只大鼠取第一軀體感覺皮質區的1張切片，使用Fluoro-Jade B（Histo-Chem Inc.）染液進行染色。25 μm厚的冠狀切片依次在包含1%氫氧化鈉的80%酒精、70%的酒精和0.06%的高錳酸鉀溶液中浸泡后，用Fluoro-Jade B染液染色。經蒸餾水沖洗后，使用DAPI復染。然后放在50℃烘干機里烘干，經二甲苯浸泡后，熒光顯微鏡（DMI400B，Leica，德國）觀察。每張切片在梗死灶周邊區隨機選取5個高倍視野，每個高倍視野分別進行Fluoro-Jade B陽性細胞和細胞核總數的計數，統計結果以每只大鼠的5個高倍視野Fluoro-Jade B陽性細胞所占平均百分比進行分析。

1.4 統計學分析 采用Prism軟件進行統計分析，神經功能行為評分的數據為偏態分布，以中位數和四分位數表示，其他數據為正態分布，以均值±標準差表示。神經功能行為評分的數據用Kruskal-Wallis檢驗分析，其余各組之間比較采用單因素方差分析及Tukey檢驗。P＜0.05被認為差異有顯著性。

2 結果

2.1 TTC染色所示適度酒精預適應對局灶性腦缺血再灌注后梗死體積的影響 TTC染色顯示：酒精預適應組的梗死體積較缺血再灌注組顯著減少[（54.83±13.43）mm3vs（242.80±17.44）mm3，P＜0.001）（圖1）。

2.2 適度酒精預適應對局灶性腦缺血再灌注后神經功能缺損的影響 3組大鼠在局灶性腦缺血再灌注后24 h進行神經功能評分顯示：3組大鼠的神經功能評分之間差異有顯著性（KW=19.28，P＜0.001）。缺血再灌注組的神經功能缺損較假手術組顯著加重（P＜0.001），酒精預適應組的神經功能缺損較缺血再灌注組減輕（P＜0.05），酒精預適應組的神經功能缺損較假手術組差異無顯著性（表2）。

2.3 磁共振成像所示酒精預適應對局灶性腦缺血再灌注后梗死體積的影響 3組大鼠在局灶性腦缺血再灌注后24 h進行頭部MRI的T2WI序列平掃，結果顯示：酒精預適應組的梗死體積較缺血再灌注組明顯減少[（59.68±9.97）mm3vs（296.80±8.53）mm3，P＜0.001]（圖2）。

圖1 大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織TTC染色圖

2.4 酒精預適應對局灶性腦缺血再灌注后細胞凋亡的影響 在缺血再灌注組大鼠的右側軀體感覺皮質區可見大量綠色的TUNEL染色陽性細胞，而通過適度酒精預適應后TUNEL染色陽性細胞數明顯減少，假手術組TUNEL染色為陰性（圖3）。3組大鼠的凋亡陽性細胞計數值差異有顯著性（F=143.3，P＜0.001，表3）。缺血再灌注組的TUNEL染色陽性細胞數所占百分比較假手術組顯著增加（P＜0.001），酒精預適應組的TUNEL染色陽性細胞數所占百分比較缺血再灌注組顯著減少（P＜0.001），酒精預適應組的TUNEL染色陽性細胞數所占百分比較假手術組顯著增加（P＜0.001）。

2.5 酒精預適應對局灶性腦缺血再灌注后神經元退化變性的影響 在缺血再灌注組大鼠的右側軀體感覺皮質區可見大量綠色的Fluoro-Jade B染色陽性細胞，而通過適度酒精預適應后Fluoro-Jade B染色陽性細胞數顯著減少，假手術組Fluoro-Jade B染色為陰性（圖4）。3組大鼠的凋亡陽性細胞計數值差異有顯著性（F=105.4，P＜0.001，表4）。缺血再灌注組的Fluoro-Jade B染色陽性細胞數所占百分比較假手術組顯著增加（P＜0.001），酒精預適應組的Fluoro-Jade B染色陽性細胞數所占百分比較缺血再灌注組顯著減少（P＜0.001），酒精預適應組的Fluoro-Jade B染色陽性細胞數所占百分比較假手術組顯著增加（P＜0.001）。

表2 酒精預適對大鼠神經功能影響

圖2 大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織磁共振成像T2WI圖

圖3 大鼠局灶性腦缺血再灌注后軀體感覺皮質區的DAPI染色陽性細胞、TUNEL染色陽性細胞及TUNEL染色陽性細胞所占百分比圖(200×)

表3 TUNEL染色所示酒精預適應對細胞凋亡的影響

表4 Fluoro-Jade B染色所示酒精預適應對神經元退化變性的影響

3 討論

腦缺血再灌注損傷會導致高死亡率和長期嚴重的生理和認知障礙[7]。其中，氧化應激反應產生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）被認為是腦缺血再灌注損傷中的關鍵，這是因為其強大的氧化和還原作用，可以消耗抗氧化劑，抵制內源性抗氧化防御系統，干擾能量代謝以及導致神經細胞凋亡[8]。但是，也有研究發現，適度酒精預適應對腦缺血再灌注損傷的保護作用可能與酒精誘導了還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（triphosphopyridine nucleotide，NADPH）形成ROS有關，這可能是因為適度酒精預適應誘導了微量ROS的形成，產生了適度的氧化應激反應，從而發揮保護作用。而且，在腎中也發現這一現象[9]。因此，ROS對機體來說可能是一把雙刃劍。除此之外，有文章報道適度酒精能誘導N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）[10]或者γ-氨基丁受體（γ－aminobutyric acid，GABA）[11]的激活，從而產生保護作用，但是確切的機制仍待研究。

圖4 大鼠局灶性腦缺血再灌注后軀體感覺皮質區的DAPI染色陽性細胞、Fluoro-Jade B染色陽性細胞及Fluoro-Jade B染色陽性細胞所占百分比圖(200×)

缺血性卒中由于病因、病程、梗死部位、缺血程度及合并系統疾病的差異，導致臨床變異性很大。目前臨床上缺血性卒中的治療主要集中在溶栓和神經保護方面[12]。而溶栓由于其時間窗很短，只有3～4.5 h[13]，因此能得到治療的患者是非常有限的。至于外源性神經保護劑，盡管許多藥物在動物模型上顯示了神經保護作用，然而在從動物到臨床的轉化研究中未能顯示同樣的效果[14]。因此，目前越來越多的研究集中在內源性神經保護方面，比如預適應[15]。

預適應是這樣一種現象：短暫的亞致死損害會為隨后發生的致死損傷提供強力的保護作用，它被認為是自然界中的一種常規形式[15]。預適應中最經典的是缺血預適應，已在多種器官中發現[16-17]。但是，由于缺血預適應在機體中難以實現，人們正熱衷于尋找合適的藥物來代替。

流行病學研究結果表明，低至中等劑量的紅酒攝入能降低心肌梗死與卒中的發生率和嚴重程度，這可能與紅酒中含有的酒精有關[18]。適度酒精預適應是預適應的一種，是指先期攝入低至中等劑量的酒精，可保護組織免受隨后的缺血/再灌注造成的損傷。要產生這一保護作用，需要血漿中的酒精濃度在短時間內（30～60 min）增加到10 mmol，這相當于人飲用1～2杯酒精飲料的水平。本研究在大鼠腦缺血再灌注前24 h灌胃95%酒精，這樣，血漿中的酒精濃度在灌胃后30 min增加到45 mg/dl的峰值，從而產生保護作用[19]。

已有研究表明，在腦缺血再灌注的動物模型中，適度酒精預適應可減輕大腦的梗死面積[20]。在本研究中，局灶性腦缺血再灌注后24 h腦組織TTC染色也得出了同樣的結果。同時，T2WI圖像結果從另一方面證明適度酒精預適應可減小局灶性腦缺血再灌注后的梗死體積。

有研究表明，適度酒精預適應能明顯減輕大鼠全腦缺血再灌注后的細胞凋亡和神經元退化變性[21]。在本研究中，TUNEL染色和Fluoro-Jade B染色的結果表明，適度酒精預適應能明顯減輕大鼠局灶性缺血再灌注后軀體感覺皮質區的細胞凋亡和神經元退化變性，提示酒精對腦缺血再灌注的保護作用可能介導了細胞凋亡和神經元退化變性途徑，其機制有待進一步研究證實。

需要指出的是，雖然本研究表明適量的酒精攝入會對機體產生保護作用，但作為動物實驗存在向臨床實際效果轉化的問題，而且本研究沒有對酒精預適應對大鼠缺血再灌注長期神經功能影響進行研究。目前，酒精的預保護作用的確切機制尚不清楚，需要再進行大量的研究來探討；酒精預適應對細胞凋亡的影響究竟是抑制細胞凋亡還是延緩了凋亡的發生，這需要大鼠腦缺血后觀察至7 d的實驗來驗證；另外，酒精預適應對腦缺血后細胞凋亡的時間效應作用也有待完善。

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