伽瑪刀照射對青霉素致癲癇貓腦組織中MDA水平、SOD活力的影響

董長征，孔艷莉，靳洪波，張素芳，鄭杰，梁傳棟，武江，岳向勇，李文玲(河北省人民醫院，石家莊05005;石家莊市第二醫院)

伽瑪刀照射對青霉素致癲癇貓腦組織中MDA水平、SOD活力的影響

董長征1，孔艷莉1，靳洪波2，張素芳1，鄭杰1，梁傳棟1，武江1，岳向勇1，李文玲1(1河北省人民醫院，石家莊050051;2石家莊市第二醫院)

摘要:目的探討伽瑪刀照射對青霉素致癲癇貓腦組織中丙二醛(MDA)水平和超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響。方法選擇雄性成年貓30只，隨機分為正常對照組、癲癇模型組和伽瑪刀治療4、8、12周組各6只。除正常對照組外，其余組通過向貓右額葉皮質注射青霉素制作癲癇模型，伽瑪刀治療4、8、12周組在造模成功后給予低劑量伽瑪刀照射。采用Racine分級標準進行行為學觀察。4周后正常對照組、癲癇模型組和伽瑪刀治療4周組均將貓處死，伽瑪刀治療8、12周組于治療8、12周后分別將貓處死，處死后均立即取出貓右額葉腦組織，采用硫代巴比妥酸比色法檢測腦組織中MDA水平，WST-1法檢測SOD活力。結果癲癇模型組貓發作級別多達到Ⅳ～Ⅵ級;伽瑪刀治療4、8周組貓癲癇發作級別和持續時間與癲癇模型組比較無統計學變化;伽瑪刀治療12周組癲癇發作級別降低，多為Ⅰ～Ⅱ級。與正常對照組比較，癲癇模型組腦組織中MDA水平升高，SOD活力降低(P均＜0.05);與癲癇模型組比較，伽瑪刀治療4周和8周組MDA水平及SOD活力無統計學變化，而伽瑪刀治療12周組MDA水平減低(P＜0.05)，SOD活力升高(P＜0.05)。結論伽瑪刀照射治療能降低青霉素致癲癇貓腦組織中MDA水平，提高SOD活力，減輕實驗貓癲癇發作后的氧化應激損傷。

關鍵詞:癲癇;伽瑪刀;氧化應激;丙二醛;超氧化物歧化酶

自由基與癲癇的發生、發展關系密切［1］。研究［2］發現，腦內脂質過氧化物顯著增加、氧自由基清除劑相對減少是癲癇發生、發展的重要原因。伽瑪刀照射對部分難治性癲癇的治療取得一定療效，為進一步研究其抗癲癇的作用機制，我們選用青霉素致癲癇貓模型，觀察伽瑪刀照射對青霉素致癲癇貓腦組織丙二醛(MDA)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響，探討伽瑪刀照射是否對癲癇發作后腦損傷具有神經保護作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康雄性成年貓30只，體質量2.5～3.5 kg，河北醫科大學實驗動物中心提供。

1.2試劑及儀器注射用青霉素(華北制藥股份有限公司，批號13020655);異丙酚(200mg/支，北京費森尤斯公司);伽瑪刀(LEKSELL C型，瑞典ELEKTA公司);磁共振儀(美國GE公司); SOD、MDA試劑盒購自南京市建成生物工程研究所。

1.3動物分組、造模及干預將30只貓按隨機數字表法分為正常對照組、癲癇模型組和伽瑪刀治療4、8、12周組，每組各6只。正常對照組不做任何處理;癲癇模型組和伽瑪刀治療組在貓額葉皮質多次注射青霉素制作癲癇模型，異丙酚靜脈麻醉，貓右額頭皮做直切口，長約3 cm，暴露貓右額葉皮層組織，用MS4000U-1生物信號定量記錄分析系統刺激器刺激腦皮質，引起對側后肢收縮的區域定為運動皮質。用微量注射器抽取青霉素1萬U，以60°角斜刺入動物右額皮質的無血管區，縫合頭皮。青霉素每間隔3d注射1次，共注射7次。伽瑪刀治療組在造模成功后給予伽瑪刀照射，3%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉實驗用貓，將其頭部安裝于Leksell立體定向頭架，用磁共振儀進行無間隔定位掃描，層厚2mm。

掃描圖像經計算機網絡傳至Gamma Plan系統制定治療計劃，確定照射靶區位于右側額葉的X、Y、Z坐標。然后將固定貓腦的Leksell框架按所定坐標安放于伽瑪刀定位架上，用4mm準直器，對靶區腦組織實施照射，邊緣劑量15 Gy，等劑量曲線50%。

1.4行為學觀察參照Racine分級標準觀察各組貓的癲癇發作行為。0級:無反應或抽搐停止;Ⅰ

級:節律性口角或面部抽動;Ⅱ級:點頭或甩尾;Ⅲ級:單肢抽動;Ⅳ級:多肢抽動或強直;Ⅴ級:全面性強直陣攣發作。視頻監控下觀察實驗貓的發作級別和持續時間。

1.5腦組織中MDA水平、SOD活力測定4周后正常對照組、癲癇模型組和伽瑪刀治療4周組均將貓處死，伽瑪刀治療8、12組于治療8、12周后分別將貓處死，立即取出右額葉腦組織稱重，用生理鹽水作勻漿介質，充分勻漿，離心，取上清液放入－70℃冰箱保存待用。嚴格按照試劑盒說明書進行分步操作，分別采用硫代巴比妥酸比色法檢測腦組織中MDA水平，WST-1法檢測SOD活力。

1.6統計學方法采用SAS8.0統計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1行為學變化正常對照組無癲癇發作。癲癇模型組均有癇性發作，為間斷性，發作級別達Ⅳ～Ⅵ級，全身強直陣攣發作多見，每次發作持續3～5min。伽瑪刀治療4、8周組癲癇發作級別和持續時間與癲癇模型組比較差異無統計學意義;伽瑪刀治療12周組癲癇發作級別減低，多為Ⅰ～Ⅱ級，表現為貓的面部抽搐或點頭動作，發作時間為1～3min。

2.2各組貓腦組織中MDA水平、SOD活力比較伽瑪刀治療后，隨著時間延長，MDA水平有減低趨勢，SOD活力有上升趨勢，伽瑪刀治療12周組MDA水平明顯降低，SOD活力明顯升高，與癲癇模型組比較，P均＜0.05，見表1。

表1　各組貓腦組織中MDA水平及SOD活力比較()

表1　各組貓腦組織中MDA水平及SOD活力比較()

注:與正常對照組比較，▲P＜0.05;與癲癇模型組比較，△P＜0.05。

組別　nmDA(nmol/mg蛋白)SOD(U/mg蛋白)正常對照組6　10.37±1.52　200.63±11.33癲癇模型組　6　31.65±1.47▲　130.72±12.24▲伽瑪刀治療4周組　6　29.54±1.17　138.27±5.37伽瑪刀治療8周組　6　25.04±2.36　145.38±8.27伽瑪刀治療12周組　6　19.16±2.01△　173.68±11.41△

3　討論

自由基過量產生引起的氧化應激損傷參與了癲癇的發生和發展過程［3，4］。正常生理情況下，腦組織內氧化與抗氧化系統處于動態平衡狀態。當機體發生癲癇時，腦組織氧代謝障礙產生大量氧自由基，氧自由基可使神經細胞膜中的多不飽和脂肪酸發生過氧化反應，且通過脂氫過氧化物的分解產物引起神經細胞損傷，導致神經細胞的內質網、線粒體、溶酶體等結構破壞，細胞膜對離子通透性的改變［5］，與此同時，機體內抗氧化酶類活性減低，清除氧自由基的能力下降，腦內氧化與抗氧化系統平衡失調，活性氧增加，從而導致腦組織氧化應激反應，造成神經細胞過氧化損傷，神經細胞興奮性增加，癲癇發作進一步加重，使氧自由基平衡系統進一步被破壞，氧自由基繼續增多，神經細胞的損傷繼續加重，形成惡性循環。

MDA是體內生物膜不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的中間產物，其對機體的損害作用主要使不飽和脂肪酸過氧化，進而造成細胞膜的持續損害，因此其含量反映了腦內脂質過氧化程度，間接反映了氧自由基對神經細胞損傷的程度［6］。

SOD是機體內防御生命活動中氧自由基破壞損傷的抗氧化酶，為機體直接清除自由基的重要酶類，其主要功能是將氧的單價還原物超氧陰離子自由基歧化成H2O2和O2，能減輕缺血缺氧導致的神經元損傷，阻斷氧自由基對機體的進一步損傷。其活力高低間接反映了機體清除氧自由基的能力［7］。

青霉素是腦內抑制性神經遞質GABA的A受體拮抗劑，常被用來建立實驗動物的癲癇模型。前期研究中，我們應用青霉素反復多次腦額葉皮質注射成功建立了貓的慢性癲癇模型，適于伽瑪刀治療癲癇的模型研究［8］。本研究結果顯示，低劑量伽瑪刀照射12周后抑制了青霉素誘導貓的癲癇發作，對控制和預防癲癇的發作有一定作用，與我們既往結果大致相同。本研究結果還顯示，與正常對照組比較，癲癇模型組MDA水平升高，而SOD活力較正常對照組明顯降低，說明癲癇反復發作后腦組織內氧化和抗氧化系統平衡被打亂，產生過量的氧自由基，SOD過量耗損而明顯減少，導致神經細胞氧化損傷，興奮性增高，異常放電增加，癲癇發作進一步發展。蔡紅衛等［9］研究認為大鼠腹腔注射戊四氮誘發抽搐發作后大鼠海馬組織中MDA水平明顯升高，SOD含量明顯減少。劉鳳英等［10］研究表明，成人癲癇存在SOD的代謝紊亂，下降的SOD可能通過損傷線粒體，增加腦內興奮性神經遞質的合成，促進神經元凋亡，進而參與成人癲癇的病理生理過程。以上研究與本研究結果相一致。與癲癇模型組比較，伽瑪刀照射12周組中MDA水平明顯降低，SOD活力明顯升高，貓的癲癇發作級別減低;伽瑪刀照射4、8周組MDA水平和SOD活力雖有變化，但變化不明顯，無統計學意義，說明伽瑪刀照射治療癲癇需一定時間后才能顯現效果;伽瑪刀照射可降低癲癇腦組織中MDA水平，提高SOD活力，從而降低腦內氧自由基含量，重建氧化和抗氧化系統的平衡，進而

實現神經保護作用，抑制貓的癲癇發作。

總之，伽瑪刀治療癲癇的機制尚不十分清楚，可能與伽瑪刀照射降低致癇灶內谷氨酸的水平［11］、抑制神經元的凋亡及相關凋亡基因的表達［12］等有關。本研究提示，抑制氧自由基引起的脂質過氧化反應，增加自由基的清除可能參與了伽瑪刀治療癲癇的生理機制，為進一步伽瑪刀治療癲癇提供了充分的實驗依據。

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收稿日期:( 2015-04-08)

基金項目:河北省衛生廳指令性計劃項目(20120009)。

文章編號:1002-266X(2015)33-0025-03

文獻標志碼:A

中圖分類號:R742.1

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.33.008