Annexin A2在類風濕性關節炎滑膜組織中的表達

Annexin A2在類風濕性關節炎滑膜組織中的表達

陳揚*

( 浙江中醫藥大學第一臨床醫學院 杭州 311422)

摘 要目的：檢測膜聯蛋白（annexin）A2在類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）滑膜組織中的表達，研究annexin A2與RA發生的相關性，期望能夠在基因水平早期診斷和治療RA，為明確RA的靶向性治療提供幫助。 方法：采用real-time PCR技術檢測annexin A2 mRNA在17例RA和15例骨性關節炎（osteoarthritis，OA）滑膜組織標本中的表達；采用蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE染色）對此32例滑膜組織標本進行了病理學觀察，從炎性細胞浸潤、纖維增生、滑膜細胞增生以及新生血管形成等4個方面加以評估。并比較兩組的annexin A2 mRNA的相對表達量以及病理學觀察評估結果。結果：annexin A2 mRNA在所有RA及OA滑膜組織樣本中均有表達，但其在RA滑膜組織中的表達量顯著高于OA滑膜組織（P<0.05）；HE染色顯示RA組及OA組間炎性細胞浸潤及纖維組織增生情況無顯著性差異(P＞0.05)，但滑膜細胞增生及新生血管形成等病理改變存在顯著性差異（P＜0.05），光學顯微鏡下在RA組可見滑膜細胞大量增生，且新生血管豐富，而這些在OA組少見。 結論：annexin A2與RA的發生關系密切，它的高表達可能在RA滑膜組織的病理改變中起到重要作用，有助于我們了解RA發生的分子生物學途徑，進而為臨床提供有針對性的治療措施。

關鍵詞類風濕性關節炎 annexin A2 real-time PCR HE染色

Expression of annexin A2 in rheumatoid arthritis synovial tissue

CHEN Yang*

(First Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 311422, China)

ABSTRACTObjective: To detect the expression of annexin A2 in rheumatoid arthritis synovial tissue, and to study the relationship between annexin A2 and the occurrence of rheumatoid arthritis (RA). Methods: The expression of annexin A2 mRNA in the synovial tissue samples of 17 cases of RA and 15 cases of osteoarthritis (OA) patients was detected by real-time PCR and their pathological observation was performed by HE staining, and four indicators such as inflammatory cell infiltration, fibrosis, synovial cell proliferation and angiogenesis were assessed. The levels of the relative expression of annexin A2 mRNA and the assessment results of pathological observation were compared between two groups. Results: Annexin A2 mRNA was expressed in both RA and OA synovial tissue samples but the amount of annexin A2 mRNA expression was significantly higher in the RA group than in the OA group (P＜0.05). HE staining showed that there were no significant differences in inflammatory cell infiltration and fibrous tissue hyperplasia but there were significant differences in pathological changes such as proliferation of synovial cells and neovascularization (P＜0.05). A large amount of synovial cell proliferation and rich angiogenesis could be found in the RA group but less in the OA group under optical microscope. Conclusion: There is a close relationship between annexin A2 and the occurrence of RA, and the high expression of annexin A2 mRNA may play an important role in pathological changes of RA synovial tissue, which can help us understand a way of molecule biology for the occurrence of RA.

KEY WORDSrheumatoid arthritis; annexin A2; real-time PCR; HE staining

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以致殘性關節病變為主的自身免疫性疾病，其病理特征主要表現為滑膜細胞異常增殖和炎性細胞浸潤，累及周身關節滑膜炎及血管翳形成，嚴重時可導致滑膜增厚，形成侵襲性血管翳，侵蝕軟骨與骨導致關節破壞，全世界約有1%的人患有此病，5～10年致殘率高達60%[1]。

但其發病原因至今仍未明確，不過可以肯定的是RA是多因子、多步驟、多階段的演進過程[2]。因此尋找與RA發生發展相關的敏感因子對其早期診斷及治療有著重要意義。

annexin A2是一類鈣依賴性膜磷脂結合蛋白，它參與細胞增殖、分化、凋亡和遷移等重要生命過程[3]。近年來國內外很多學者發現annexin A2的高表達與RA的發生密切相關[4-5]，但其在RA發生發展中的作用機制卻鮮見報道。本研究應用real-time PCR來評估RA滑膜組織中annexin A2 mRNA表達，HE染色觀察RA滑膜組織病理情況，判斷annexin A2的表達和RA的發生發展是否相關。為明確RA發生的分子生物學途徑提供思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集浙江中醫藥大學附屬第一醫院骨傷科2013年3月-2014年6月膝關節置換術切除的類風濕性關節炎（RA）滑膜組織標本17例，骨性關節炎（osteoarthritis, OA）滑膜組織標本15例。每一個標本的收集都取得了患者知情同意。所有RA患者均符合美國風濕病學會（ACR）1987年修訂的診斷標準[6]：①早起關節僵硬至少l h（≥6周）；②3個以上關節腫脹（≥6周）；③手關節或掌指關節或近端指間關節腫脹（≥6周）；④對稱性腫脹；⑤手的X線改變。⑥皮下結節；⑦類風濕因子陽性。如具備4項以上指標即可確診。所有OA患者均根據1995年美國風濕病協會修訂的診斷標準[7]，即：①一個月來大多數時間發生膝痛；②X線片示關節邊緣骨贅；③關節液檢查符合骨關節炎（清晰、黏稠、WBC＜2×109/L）；④年齡≥40歲；⑤晨僵≤30 min；⑥關節活動時有關節摩擦音，診斷標準：①②確診或①③⑤⑥確診或①④⑤⑥確診。所有標本離體后迅速放置于-80℃超低溫冰箱保存。

1.2 實驗主要儀器與試劑

主要儀器：iQ5 PCR儀（美國Bio-Rad公司）、臺式高速離心機（德國Heraeus公司）、超低溫冰箱（日本SANYO公司）、臺式恒溫振蕩器（江蘇太倉實驗儀器廠）、恒溫水浴箱（上海醫療器械七廠）、超凈工作臺（蘇州三興凈化公司）、紫外分光光度儀（美國Thermo公司）、切片機（德國Microm公司）等均由浙江中醫藥大學動物實驗室提供。

主要試劑：HE染色試劑盒（江蘇碧云天）；熒光定量試劑盒（SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Perfect Real Time））、RNA提取試劑（Takara RNAiso Plus）、逆轉錄試劑盒（PrimeScriptTM RT reagent）均購自Takara公司。熒光定量PCR引物序列由生工生物工程（上海）有限公司設計并合成。

1.3 實驗方法

1.3.1 annexin A2 mRNA表達的檢測

將收集的滑膜組織標本放入-80 ℃冰箱保存待檢，提取總RNA時將標本置于裝有液氮的研缽中研磨呈粉末狀，加入1 ml RNAiso plus（Takara公司），按說明書操作提取RNA，并測定RNA的濃度、純度及完整性。逆轉錄反應按照RT-reagent逆轉錄試劑盒（Takara公司）說明書進行，將逆轉錄反應體系加到無RNase的PCR管內，42 ℃ 40 min，95 ℃ 5 min，將獲得的cDNA保存于4 ℃冰箱備用。

annexin A2基因擴增上游引物：5’-TCTACTGTTCACGAAATCCTGTG-3’，下游引物：5’-AGTATAGGCTTTGACAGACCCAT-3’，擴增長度：90 bp。內對照GAPDH上游引物：5’-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’，下游引物：5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’，擴增長度：143 bp。熒光定量PCR反應按Takara公司產品說明書操作：將cDNA用實時熒光定量PCR儀進行擴增，95 ℃預變性3 min，然后95 ℃ 10 s、60 ℃（退火溫度根據不同引物而不同）退火30 s；總共48個循環。熔解曲線：從55 ℃開始，每30 s升高0.5 ℃，直到95 ℃，循環一次。實驗總共重復3次。

所有反應信息資料由iQ5 PCR儀收集，Ct值通過該PCR儀內置的相對定量分析軟件來測量和計算，轉錄水平通過比較閾值法計算[8]，計算方法是，△△Ct=實驗組△Ct（目的基因Ct值-內參基因Ct值）-對照組△Ct（目的基因Ct值-內參基因Ct值）。計算2—△△Ct作為目的基因的相對表達量。

1.3.2 滑膜組織病理觀察

解凍RA組及OA組滑膜組織，于40%福爾馬林溶液中保存，常規脫水、浸蠟、包埋、切片、HE染色。光學顯微鏡下觀察兩組滑膜增生、新生血管、炎性細胞浸潤及纖維組織增生等病理學變化，根據Tsubaki等[9]相

關文獻進行評分（表1）。

表1 各組滑膜HE染色評分的4項標準

1.4 統計分析

應用SPSS 19.0統計軟件包，兩組annexin A2 mRNA的相對表達量以及HE染色評分結果以均數±標準差（x±s）表示，兩組數據間差異分析采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為具有統計學意義。

2 結果

2.1 annexin A2 mRNA的表達

real-time PCR擴增內參照GAPDH、RA及OA滑膜組織中的annexin A2基因，結果表明擴增為特異性擴增，產物為目的基因，而不是引物二聚體，定量準確。經檢測發現所有RA及OA滑膜組織樣本均有annexin A2 mRNA的表達，其相對表達量以（x±s）表示（表2）。經兩組間獨立樣本t檢驗，發現annexin A2 mRNA的相對表達量在RA滑膜組織中明顯高于OA滑膜組織，且差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 annexin A2 mRNA在滑膜組織中的表達量

2.2 HE染色觀察滑膜組織病理情況

正常情況下，由1～2層滑膜細胞及滑膜下層組成滑膜襯里層，且只有少量纖維組織和血管，無炎性細胞浸潤。RA組及OA組均有大量炎性細胞浸潤，且有纖維組織增生，但OA組少見滑膜細胞增生及新生血管形成，而RA組光學顯微鏡下可見滑膜細胞大量增生，可達8層以上，且新生血管豐富（圖1）。兩組HE染色評分經獨立樣本t檢驗發現，炎性細胞浸潤及纖維組織增生情況無顯著性差異（P＞0.05），但是滑膜細胞增生及新生血管形成等病理改變存在顯著性差異（P＜0.05，表3）。

圖1 OA組與RA組滑膜組織病理切片對比

表3 各組滑膜組織HE染色評分（x ±s）

3 討論

annexin A2以往多見于其與惡性腫瘤、血液病及抗磷脂綜合征等疾病的相關性研究報道，而近年來Salle等[4]國內外學者發現RA患者中存在annexin A2的高表達，提示其與RA的發展密切相關。而Goulding等[10]早在1995年的研究報道中指出在包括內襯層的類風濕標本染色后，在血管周圍和組織間質的巨噬細胞內，annexin A2有著與annexin A1類似的分布，尤以血管周圍的分布最為突出。同時Bo等[11]通過對人類關節炎滑膜成纖維細胞的差異蛋白質組分析提示annexin A2可能成為治療RA的新靶點。本研究表明，annexin A2 mRNA在RA和OA的滑膜組織中均有表達，但其表達量在RA滑膜組織中明顯高于OA滑膜組織，且差異具有統計學意義。RA和OA在滑膜病變過程中均有大量炎性細胞浸潤和纖維組織增生，但RA滑膜組織同時存在大量滑膜細胞的增生以及血管翳的形成，且這種病理改變差異具有統計學意義。因此本研究更進一步證實了annexin A2與RA發生及發展的相關性。

有研究報道annexin A2可能通過TLR4激活巨噬細胞[12]，從而上調炎癥反應；AIIt作用于人單核源性巨噬細胞后可導致促分裂原活化蛋白激酶快速磷酸化和NF-κB的激活[13]，并促進TNF-α、IL-1β和IL-6等大量可趨化白細胞的細胞因子分泌。這些均暗示annexin

A2對炎癥反應進展有級聯放大作用。本研究表明其相對表達量在RA滑膜組織中明顯高于OA滑膜組織，且這種差異具有統計學意義。RA和OA在滑膜病變過程中均有大量炎性細胞浸潤，因此表明annexin A2與RA和OA可能在滑膜炎性改變存在較大的相關性，但annexin A2 在RA滑膜組織中的高表達并沒有引起兩組滑膜組織炎性細胞浸潤的顯著性差異，其在RA滑膜組織炎性反應中所起的具體作用機制值得進一步研究，尤其是annexin A2的各種存在形式在炎癥反應中所起的不同作用。

本研究發現RA滑膜組織同時存在大量血管的增生以及血管翳的形成，且有研究指出annexin A2與血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達相關聯[14]，而VEGF亦是促進RA滑膜血管翳形成的最重要的細胞因子[15]。Nagashima等[16]通過免疫組化技術發現，VEGF在RA的滑膜襯里巨噬樣滑膜細胞、血管平滑肌細胞和關節軟骨細胞中表達。由此說明annexin A2在RA的特異性的病理變化中起到較為關鍵的作用。

annexin A2參與細胞增殖，與腫瘤的發生發展、浸潤、遠處轉移均有不同程度相關[17]，而RA累及周身關節的增生性和侵蝕性滑膜炎的臨床特點極類似于“局限性惡性腫瘤”的增生性和破壞性病變，呈進行性發展[18]，由此進一步表明了annexin A2在RA滑膜組織中的高表達在RA病理改變中的獨特意義。

總之，annexin A2與RA發生關系密切，其可能通過調控炎性細胞浸潤，促進滑膜細胞增殖，參與滑膜血管翳形成，以及刺激破骨細胞分化成熟，從而導致關節的破壞，造成關節功能障礙，甚至致殘。但其在RA發生、發展及轉歸中的具體作用途徑仍有待進一步的探索和拓展。我們相信隨著對annexin A2與RA發展關系的深入研究及闡明，annexin A2有望被用于類風濕性關節炎的早期檢測、輔助診斷及治療的靶向分子，進而為臨床提供有針對性的治療措施。

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收稿日期：（2015-02-02）

作者簡介：*陳揚（1989-），男，在讀碩士研究生。研究方向：骨傷外科。E-mail：chen19891022@126.com

文章編號：1006-1533(2015)09-0045-04

文獻標識碼：A

中圖分類號：R593.22