急性胰腺炎與自噬及其關鍵分子Beclin1相關研究進展

李欽芳　湛先保

200433　上海，第二軍醫大學長海醫院消化內科

?

急性胰腺炎與自噬及其關鍵分子Beclin1相關研究進展

李欽芳湛先保

200433上海，第二軍醫大學長海醫院消化內科

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是指多種病因引起的胰酶激活，伴有胰腺局部炎癥反應，病情較重者可發生全身炎癥反應綜合癥(SIRS)，并可并發器官功能障礙[1]。長期以來人們都認為腺泡細胞內胰蛋白酶原的異?；罨茿P的主要發病機制。然而進一步研究發現，它只是在AP的病程早期發揮重要作用，而與局部及全身炎癥反應密切相關的是早期階段腺泡細胞內炎癥因子活化[2]。隨著發病率逐年升高，AP發病機制的相關研究在基礎研究領域已成為熱點，自噬在胰腺外分泌部的生理功能和AP中發揮著重要的作用，AP發病機制的完善有待于包括對腺泡細胞內自噬、溶酶體功能等在內的深入研究。

一、自噬與胰腺炎

“自噬”一詞源于希臘，寓為“自我吞食”，它是將細胞內營養物質循環利用的有效途徑，在維持細胞穩態中起著重要作用。自噬至少分為3種類型：巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬，此外還有與巨自噬形態學相似的過氧化物酶體自噬、線粒體自噬等。而通常所說的自噬往往指的是巨自噬。首先，內質網和線粒體形成雙層膜結構的隔離膜[3]，隔離膜將胞質內的細胞器和蛋白包繞隔離起來形成吞噬泡，吞噬泡邊緣的新生膜延伸融合形成雙層膜結構的囊泡，即為自噬體。自噬體經歷了逐步成熟的過程，包括與酸化的內涵體和(或)溶酶體融合，最終胞質內物質進入溶酶體中融合、降解和重新利用。哺乳動物的自噬過程主要分為起始、成核、延伸、閉合、成熟和降解6個步驟。

胰腺是人體重要的器官，外分泌胰腺的基本生理功能為分泌大量的消化酶包括淀粉酶、脂肪酶和各種蛋白酶。Mizushima等[4]發現胰腺外分泌部的基礎自噬水平顯著高于肝臟、腎臟、心臟或胰腺內分泌部，并發現自噬可調節胰蛋白酶原顆粒的數量。Gukovskaya等[5]對小鼠離體實驗的研究結果也發現在胰腺腺泡細胞中存在大量的生理性自噬。這可能是由于胰腺腺泡細胞內蛋白質代謝旺盛，容易產生錯誤折疊蛋白的積聚之故。Gukovsky等[6]認為高效的生理性自噬能預防胰腺炎。當敲除自噬相關基因Atg7時，可導致腺泡細胞萎縮退化，胰腺纖維化，繼而引發慢性胰腺炎(CP)。

自噬在胰腺炎中的作用目前仍存在較多爭議。Hashimoto等[7]敲除小鼠自噬相關基因Atg5后并未觀察到胰腺炎的表型，但胰蛋白酶原活性下降，從而認為自噬是胰腺炎危險因素，在AP早期自噬可通過溶酶體機制活化胰蛋白酶原。 但Grasso等[8]則認為選擇性自噬是胰腺炎的保護因素，能在胰腺炎早期清除異?；罨囊鹊鞍酌冈６钚碌膶嶒炞C據表明，至少在小鼠中，自噬障礙能導致胰腺炎的發生[9-11]。Gukovsky等[12]在胰腺炎相關的體內外實驗中發現，胰腺腺泡細胞中存在溶酶體和線粒體等重要細胞器的功能障礙。自噬是一個動態的過程即自噬流(autophagic flux)，包括自噬體的形成、自噬體底物向溶酶體的運送以及在溶酶體內降解的整個過程。自噬體只是自噬流過程中的一個中間產物，僅僅以自噬體數量來反映自噬強弱并不準確。AP時溶酶體功能障礙導致自噬流不暢，引起溶酶體相關的自噬障礙。有觀點認為胰腺炎時的溶酶體功能障礙是由組織蛋白酶(包括組織蛋白酶B和組織蛋白酶D等)和大部分溶酶體水解酶成熟和活化異常引起。也有觀點認為是由于胰腺炎中溶酶體膜蛋白LAMP-1和LAMP-2下降所致。溶酶體功能障礙在胰腺炎的早期起著重要的促進炎癥發生和進展的作用。自噬受損導致腺泡細胞中空泡堆積；組織蛋白酶成熟及活化異常導致腺泡細胞內活化的胰蛋白酶原顆粒堆積，胰蛋白酶異?；罨纳呤且认傺椎闹匾獦酥?；而LAMP-2缺乏導致炎癥和腺泡細胞壞死。因此，自噬和溶酶體功能障礙在胰腺炎中起著重要作用。另外，線粒體受損促進自噬，使溶酶體負荷增加，從而進一步導致溶酶體功能受損。因此，溶酶體和線粒體功能不全都可通過影響細胞的自噬功能，從而在胰腺炎的發生過程中起著促進作用。而自噬功能不全導致胰腺炎的機制尚待闡明。

二、Beclin1在自噬中的作用

自噬往往依賴于Atg5和Atg7基因，Atg5/Atg7依賴性自噬與微管相關蛋白輕鏈3(LC3)的切斷和脂化有關。然而Atg5/Atg7敲除的細胞仍可見自噬體，卻無LC3的表達，說明Atg5/Atg7非依賴性的自噬通路與LC3無關，但參與了晚期內涵體和轉運高爾基體源性的自噬體的形成。值得一提的是，無論是Atg5/Atg7依賴性還是非依賴性的自噬均需要Beclin1的參與[13]。Beclin1是酵母自噬基因Atg6/Vps30在哺乳動物中的同源類似物。1998年Liang等[14]發現Bcl-2為Sindbis病毒性腦炎的保護性因素，于是運用酵母雙雜交系統研究與Bcl-2相互作用的因子時發現在熒光共振能量轉移顯微鏡下有一個分子量為60 000的新型蛋白，即Beclin1。Beclin1主要存在于胞質中，形態卷曲，包含BH3、CCD與ECD 3種結構域，這些結構域可以與多種蛋白相互作用，參與自噬和凋亡的調節。通過ECD結構域，Beclin1與PtdIns3KC3結合，使其磷酸化為有活性的PtdIns(3)P，然后與Atg蛋白相互作用，參與自噬體的形成；Beclin1通過CCD和BH3結構域相互聚合形成寡聚體，參與一些自噬因子的活化，從而起到正向調節自噬作用。酵母及哺乳動物中均存在兩種穩定的Beclin1復合體。Atg6/Beclin 1、Vps34/PtdIns3KC3和Vps15/p150(后者是PtdIns3KC3的蛋白調節激酶)形成復合體，并在此基礎上與不同的蛋白相互結合，在自噬的不同階段中發揮作用。一方面，該復合體與Atg14或其哺乳動物的同源物質Atg14L(又名Barkor)結合，稱為復合物Ⅰ，在Atg14或Atg14L引導下，參與自噬前體結構(PAS)的形成。另一方面，該復合體與Vps38或其哺乳動物的同源物質UVRAG結合，稱為復合物Ⅱ，在酵母中參與液泡蛋白的分選，但在哺乳動物中該復合物是否參與自噬體的形成仍有爭議。近年研究的結果傾向于復合物Ⅱ與自噬無關，而最新研究則認為復合物Ⅱ參與胞內物質的降解和細胞分裂過程。在鼠類巨噬細胞和線蟲中發現Beclin1參與細胞的內吞作用和蛋白分選，但是否需要UVRAG的參與還有待進一步研究。此外，與Beclin1相互作用的蛋白還有Ambra1、Bif-1、Rubicon和Bcl-2。這些分子抑或是這兩種復合物的抑制因子，抑或是促進因子，參與自噬的調節，其調節作用多為一過性，在特定的病理或生理情況下參與復合物Ⅰ及Ⅱ的調節[15]。如Bcl-2通過與Beclin1的BH3結構域結合可以抑制自噬的發生。而一旦Bcl-2或Beclin1磷酸化，或者Beclin1泛素化，二者的結合將受影響，使Beclin1從Bcl-2/Bcl-XL上解離下來，促進自噬的產生。

三、Beclin1與急性胰腺炎

Beclin1與胰腺疾病間的關系尚不明了。較為肯定的是沉默Beclin1可以促進胰腺癌細胞的自噬及降低吉西他濱誘導的凋亡，換而言之，Beclin1可以抑制胰腺癌細胞的自噬，促進凋亡[16]。Beclin1在AP中的作用研究很少。Zhang等[17]注射雨蛙素(10或50 μg/kg)至雄性小鼠的腹腔內。采用免疫組化技術發現正常對照組Beclin1散在于腺泡細胞胞質中，包括內質網和非特異性區域；10 μg/kg雨蛙素造模組的Beclin1聚集于腺泡細胞中央位置，總量稍有減少；50 μg/kg雨蛙素造模組的Beclin1濃聚于大的自噬體和小的自噬泡中，但總量驟降。蛋白印跡法提示雨蛙素造模后Beclin1總量明顯降低。免疫共定位技術觀察到VMP1、Beclin1、LC3共同位于自噬體膜上，提示這些蛋白可能相互作用誘導自噬的產生。免疫細胞化學和蛋白印跡法檢測均發現在雨蛙素誘導的胰腺炎中Beclin1表達下調，提示細胞內存在Beclin1的消耗或者其他未知作用機制存在。在雨蛙素誘導的小鼠AP模型中，Beclin1的下調程度與雨蛙素劑量成正相關。Miller等[18]認為VMP1是自噬相關膜蛋白，它參與雨蛙素誘導的AP時細胞的自噬的形成。近期研究發現，VMP1通過與Beclin1的BH3結構域相互作用調節胰腺細胞中自噬體的形成。在人體細胞中，它可以使Beclin1-hVps34復合體聚集，從而調節自噬體的形成。Miller等[18]還發現，VMP1的Atg結構域與Beclin1-BH3的親和力大于Beclin1與Bcl-2的親和力，可以使Beclin1與Bcl-2解離，促進自噬的產生。VMP1-Atg也參與Ⅲ型PI3K復合物的形成，并且在自噬中有協同作用。此外，VMP1-Beclin1-hVps34復合物還參與LC3的形成。Mareninova等[19]采用蛋白質印跡法檢測到雨蛙素誘導的AP大鼠Beclin1表達上調，提示AP時Beclin1相關的自噬增加。盡管迄今研究結果不一，但可見Beclin1與雨蛙素誘導的AP的自噬有關。

綜上所述，自噬是AP發生過程重要的病理現象，自噬流障礙參與了胰蛋白酶原的活化和AP的發生。自噬啟動的關鍵分子Beclin1在AP發生中的變化研究結果尚不一致，其病理生理意義也不明了。進一步深入研究將有助于闡明AP時自噬的發生機制，不僅有助于深入揭示AP的發生機制，甚至有助于探索AP的治療方法和靶點。

參考文獻

[1]中華醫學會消化病學分會胰腺疾病學組，《中華胰腺病雜志》編輯委員會，《中華消化雜志》編輯委員會. 中國急性胰腺炎診治指南(2013,上海). 中華胰腺病雜志, 2013,13:110-112.DOI: 10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.02.001.DOI：10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.02.001.

[2]Kaufmann A, Rossler OG, Thiel G. Expression of the transcription factor Egr-1 in pancreatic acinar cells following stimulation of cholecystokinin or Galphaq-coupled designer receptors[J]. Cell Physiol Biochem, 2014,33(5):1411-1125.DOI：10.1159/000358707.

[3]Tooze SA, Yoshimori T. The origin of the autophagosomal membrane[J]. Nat Cell Biol, 2010,12(9):831-835.DOI:10.1038/ncb0910-831.

[4]Mizushima N, Yamamoto A, Matsui M, et al. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker[J]. Mol Biol Cell, 2004,15(3):1101-1111.DOI:10.1091/mbc.E03-09-0704.

[5]Gukovskaya AS, Gukovsky I. Autophagy and pancreatitis[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2012,303(9):G993-G1003.DOI:10.1152/ajpgi.00122.2012.

[6]Gukovsky I, Li N, Todoric J, et al. Inflammation, autophagy, and obesity: common features in the pathogenesis of pancreatitis and pancreatic cancer[J]. Gastroenterology, 2013,144(6):1199-1209.DOI:10.1053/j.gastro.2013.02.007.

[7]Hashimoto D, Ohmuraya M, Hirota M, et al. Involvement of autophagy in trypsinogen activation within the pancreatic acinar cells[J]. J Cell Biol, 2008,181(7):1065-1072.DOI:10.1083/jcb.200712156.

[8]Grasso D, Ropolo A, Lo Re A, et al. Zymophagy, a novel selective autophagy pathway mediated by VMP1-USP9x-p62, prevents pancreatic cell death[J]. J Biol Chem, 2011,286(10):8308-8024.DOI:10.1074/jbc.M110.197301.

[9]Li N, Wu X, Holzer RG, et al. Loss of acinar cell IKKalpha triggers spontaneous pancreatitis in mice[J]. J Clin Invest, 2013,123(5):2231-2243.DOI:10.1172/jci64498.

[10]Diakopoulos KN, Lesina M, Wormann S, et al. Impaired autophagy induces chronic atrophic pancreatitis in mice via sex- and nutrition-dependent processes[J]. Gastroenterology, 2015,148(3):626-638.DOI:10.1053/j.gastro.2014.12.003.

[11]Gukovsky I, Gukovskaya AS. Impaired autophagy triggers chronic pancreatitis: lessons from pancreas-specific atg5 knockout mice[J]. Gastroenterology, 2015, 148(3):501-505.DOI:10.1053/j.gastro.2015.01.012.

[12]Gukovsky I, Pandol SJ, Mareninova OA, et al. Impaired autophagy and organellar dysfunction in pancreatitis[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2012,27 Suppl 2:27-32.DOI:10.1111/j.1440-1746.2011.07004.x.

[13]Nishida Y, Arakawa S, Fujitani K, et al. Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy[J]. Nature, 2009,461(7264):654-658.DOI:10.1038/nature08455.

[14]Liang XH, Kleeman LK, Jiang HH, et al. Protection against fatal Sindbis virus encephalitis by beclin, a novel Bcl-2-interacting protein[J]. J Virol, 1998,72(11):8586-8596.

[15]曹大龍, 劉黎明. RNA干擾技術在腫瘤基因治療中的研究進展[J]. 醫學綜述, 2015,14:2546-2569.DOI:10.3969/j.issn.1006-2084.2015.14.026.DOI:10.3969/j.issn.1006-2084.2015.14.026.

[16]Li X, Yan J, Wang L, et al. Beclin1 inhibition promotes autophagy and decreases gemcitabine-induced apoptosis in Miapaca2 pancreatic cancer cells[J]. Cancer Cell Int, 2013,13(1):26.DOI:10.1186/1475-2867-13-26.

[17]Zhang L, Zhang J, Shea K, et al. Autophagy in pancreatic acinar cells in caerulein-treated mice: immunolocalization of related proteins and their potential as markers of pancreatitis[J]. Toxicol Pathol, 2014, 42(2):435-457.DOI:10.1177/0192623313486967.

[18]Miller KJ, Raulefs S, Kong B, et al. Loss of ifnar1 in pancreatic acinar cells ameliorates the disease course of acute pancreatitis[J]. PLoS One, 2015,10(11):e0143735.DOI:10.1371/journal.pone.0143735.

[19]Mareninova OA, Hermann K, French SW, et al. Impaired autophagic flux mediates acinar cell vacuole formation and trypsinogen activation in rodent models of acute pancreatitis[J]. J Clin Invest, 2009,119(11):3340-3355.DOI:10.1172/jci38674.

(本文編輯：屠振興)

(收稿日期：2015-12-07)

通信作者：湛先保，Email: zhanxianbao@126.com

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.02.018