重組人可溶性白細胞介素-4受體蛋白抑制大鼠哮喘研究

楊光勇 郭海濤 劉茜明 何光志 田維毅 蔡 琨 王 平 梁建東 王文佳 韓 潔

重組人可溶性白細胞介素-4受體蛋白抑制大鼠哮喘研究

楊光勇 郭海濤 劉茜明 何光志 田維毅 蔡 琨 王 平 梁建東 王文佳 韓 潔

目的探討重組可溶性白細胞介素-4受體（IL-4R）對大鼠哮喘模型的影響。方法根據GenBank公布的Homo sapiens（human）IL-4R基因序列（XM_005255309），合成srhIL-4R基因片段，將合成基因片段插入pET-28a（+）構建重組表達載體pET-28a(+)-srhIL-4R，酶切鑒定后，將載體轉入表達菌株BL21（DE3）進行誘導表達重組蛋白srhIL-4R，并用SDS-PAGE和Western-blotting方法分析重組蛋白。提取重組蛋白干預哮喘模型大鼠，取肺組織進行病理切片觀察。結果重組載體pET-28a（+）-srhIL-4R酶切獲得長度為500bp～750bp的目的片段，表達載體pET-28a（+）-srhIL-4R轉入表達菌BL21（DE3）后經IPTG誘導表達出的重組蛋白經SDS-PAGE和Westernblotting方法可見重組蛋白分子量約為25kDa；重組人可溶性IL-4R蛋白干預哮喘大鼠可見肺組織炎細胞數量較模型組明顯減少。結論srhIL-4R防治哮喘具有一定作用。

大鼠；哮喘模型；重組人可溶性白細胞介素-4受體；重組蛋白

白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）是參與哮喘發病的重要細胞因子，白細胞介素-4α鏈（IL-4Rα）的胞外結構域可溶性白細胞介素-4受體（soluble interleukin-4 receptor，sIL-4R）與白細胞介素-4（IL-4）具有高度特異結合能力，使得sIL-4R可以作為IL-4拮抗劑[1]。本研究由上海吉爾吉斯生物工程有限公司合成片段轉入pET-28a（+）構建表達載體轉化表達菌株BL21（DE3）表達進行誘導表達重組人可溶性白細胞介素4受體（recombinant soluble human interleukin-4 receptor，srhIL-4R），提取srhIL-4R蛋白干預哮喘大鼠模型，旨在為下一步進行srhIL-4R治療哮喘研究提供前期工作基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料 SPF級SD大鼠購自重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司；實驗動物合格證號：SCXK（渝）2012-0005；飼養條件：室溫清潔屏障環境。滅活百日咳桿菌原液，購自北京天壇生物制品股份有限公司；氫氧化鋁[AL（OH）3]、卵清蛋白（ovalbumin，OVA），購自北京索萊寶生物科技有限公司；超聲霧化器，購自美久陽公司；DNA Marker DL2000、大腸桿菌DH5α，均購自上海生工；限制性內切酶（Nde I和Xho I），MBI公司產品；原核表達載體pET-28a（+），invitrogen產品；QIAquick膠DNA回收試劑盒，QIAGEN公司產品；一抗鼠抗srhIL-4R血清，由本實驗室制備保存；羊抗鼠辣根過氧化物酶偶聯IgG，購自南京聯科。

1.2 方 法

1.2.1 重組人可溶性白細胞介素-4受體（soluble human interleukin-4 receptor，srhIL-4R）基因擴增與克隆 根據人可溶性白細胞介素4受體基因在Gen-Bank中公布的序列（XM_005255309），由上海吉爾吉斯生物工程有限公司合成srhIL-4R重組基因片段。合成序列采用PCR進行擴增，依據參照文獻[2]擴增srhIL-4R基因引物，略有改動，srhIL-4R-Forward：5’-CGCCATATGCATGAAGGTCTTGCAGGAGC-3’（下劃線表示Nde I酶切位點），srhIL-4R-Reverse：5’-CTCGAGCGGGTGCTGCTCGAAGGGCTC-3’（下劃線表示Xho I酶切位點）。采取膠回收試劑盒回收目的片段，再連接pMD18-T克隆載體后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，并將DH5α鋪于氨芐青霉素的固體LB培養基（含50mg/L）中，37℃培養12～16h。

1.2.2 構建重組載體pET-28a（+）-srhIL-4R 挑單個大腸桿菌DH5α菌落提取質粒DNA，用Nde I和Xho I進行雙酶切并純化回收srhIL-4R重組基因片段和pET-28a（+）載體，并進行膠回收目的片段，在16℃進行連接成重組載體pET-28a（+）-srhIL-4R，將連接產物轉化感受態DH5α，涂在含有卡拉霉素的LB固體培養基（含50mg/L）平板中37℃培養18h。挑取單個菌落采用Nde I和Xho I進行雙酶切鑒定，將酶切為陽性菌落送生物公司測序。

1.2.3 表達重組蛋白srhIL-4R將測序正確的菌落進行抽提質粒pET-28a（+）-srhIL-4R 轉化E.coli BL21（DE3）涂于LB含50mg/L卡拉霉素固體培養基中進行培養，挑取PCR鑒定為陽性的菌落到20mL 含50mg/L卡拉霉素，1mmol/L IPTG的液體LB培養液中進行誘導表達重組人可溶性白細胞介素-4受體(srhIL-4R)。

1.2.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE） 從37℃培養2～3h的菌液中取出1mL離心取菌體，加入180μL細菌裂解液（含PMSF1.8μL）重懸菌體，置于冰上30min，10 000×g，4℃離心15min，取上清和沉淀物加入適量的蛋白上樣緩沖液煮沸5min，分別進行SDS-PAGE并進行考馬斯亮藍染色。

1.2.5 蛋白質印跡（Western-blotting） 確定srhIL-4R在菌體表達的最佳條件后再進行大量表達，提取表達產物并采用Ni柱純化表達蛋白進行SDSPAGE，割取目的蛋白膠條進行半干式轉印，取出硝酸纖維素膜條進行Western-blotting分析。采用0.01 mol/L PBS（pH=7.2）洗膜；加入包被液進行孵育，洗膜后加入一抗（鼠抗IL-4R血清，1：500稀釋）進行孵育，洗膜后，加入二抗羊抗鼠辣根過氧化物酶偶聯IgG（1：8000 PBS稀釋）進行反應，洗膜后加入顯色液（TMB Substrate）進行避光顯色，直到出現清晰條帶后加蒸餾水中終止顯色反應。

1.2.6 srhIL-4R干預哮喘模型大鼠 依據參考文獻[3]，將60只SD大鼠隨機為空白對照組、模型組、布地奈德西藥組和重組蛋白srhIL-4R組，各15只。模型組、西藥組和srhIL-4R組實驗大鼠采用在腹部皮下三處注射10%OVA（含OVA 100mg、AL（OH）3100mg）與滅活的百日咳桿菌（5×109個/mL）的混合液1mL進行致敏1周，空白對照組在腹部皮下三處注射生理鹽水1mL。共致敏2次，每次間隔1周，第2次致敏1周后進行激發。分別把模型組、布地奈德西藥組和SrhIL-4R組的實驗大鼠放入封閉的箱中，濃度為5%OVA用超聲霧化器進行激發30min，持續10天；空白對照組用生理鹽水進行霧化處理。

依據參考文獻[4]，每次霧化激發前30min，對西藥組大鼠腹腔注射0.5mL布地奈德稀釋液，srhIL-4R組大鼠用0.5mL的IL-4R重組蛋白（1g/L）稀釋液，空白對照和模型組大鼠分別注射0.5mL的生理鹽水。最后一次激發4h后處死大鼠，取肺進行組織切片病理學觀察。

2 結 果

2.1 PCR擴增與克隆 合成srhIL-4R基因片段用引物進行PCR擴增，經1.2%瓊脂糖電泳得到在500bp～750bp之間的條帶，與預期擴增片段長度相似，見圖1（封二）。

2.2 酶切鑒定 pET-28a（+）-srhIL-4R載體經Nde I和Xho I雙酶切鑒定得到500bp～750bp的目的片段，結果表明srhIL-4R基因片段已插入pET-28a（+）載體，見圖2（封二）。選擇雙酶切鑒定為陽性菌落送生物公司測序，其測序結果與GenBank中公布的sIL-4R序列（XM_005255309）同源性達100%，提示srhIL-4R成功插入表達載體。

2.3 SDS-PAGE和Western-blotting分析 上清和沉淀物分別進行SDS-PAGE分析，結果顯示目的蛋白主要以包涵體形式存在，純化后進行SDS-PAGE發現表達蛋白大小接近25kDa，而含空載體的細菌沉淀物經誘導后無條帶出現。割取目的膠條進行Western-blotting分析，發現含pET-28a（+）-srhIL-4R菌表達產物在大小接近25kDa出現條帶，而空載體pET-28a（+）菌表達產物在大小接近25kDa沒有出現條帶，見圖3（封二）。

2.4 IL-4R干預過敏性哮喘大鼠的病理觀察 模型組大鼠出現呼吸加深加快，點頭張口呼吸、毛色黯淡無光、反應遲鈍、出現抓臉現象，聽診有哮鳴音；而正常組、srhIL-4R組和布地奈德西藥組大鼠則正常。肺組織病理切片顯示，正常組SD大鼠未見炎細胞浸潤，肺泡大小正常見，見圖4（封二）；模型組可見嗜酸性粒細胞、漿細胞和單核細胞等炎性細胞浸潤，見圖5（封二）；與模型組比較，srhIL-4R組和布地奈德西藥組肺組織嗜酸性粒細胞、漿細胞和單核細胞等炎細胞數量明顯減少，見圖6～7（封二）。

3 討論

重組蛋白是利用基因重組技術，重新排列目的基因，構建重組表達載體利用原核或真核表達系統以表達出來的具有目的基因特異性作用的蛋白，在生命科學領域有著極其重要的價值。IL-4是引起哮喘的關鍵細胞因子之一，sIL-4R是其拮抗劑，可以緩解或抑制哮喘的發生發展[5-6]，因此srhIL-4R重組蛋白表達的成功與否是本研究順利進行的關鍵。本研究委托上海吉爾吉斯生物工程有限公司合成srhIL-4R基因片段轉入pET-28a（+）表達載體轉化表達菌株BL21（DE3）表達進行誘導表達。

肺組織中嗜酸性粒細胞、漿細胞和單核細胞等炎性細胞的大量浸潤是哮喘發生時的特異性病理改變，且病理觀察簡單直觀，故以此作為大鼠哮喘模型成功與否及藥物布地奈德治療和srhIL-4R重組蛋白干預哮喘模型的參考指標。

編碼可溶性白細胞介素-4受體蛋白基因（IL-4Rα）在哮喘的發病中有著不可忽視的作用[5]。當IL-4Rα鏈第 576位谷氨酰胺被精氨酸所代替（Q576R），而Q576R基因多態性能夠選擇性增強IL-4Rα鏈信號作用，從而加重哮喘癥狀[4]。已經證實人類IL-4Rα單克隆抗體在治療重癥哮喘方面體現出了一定的效果[7]。重組蛋白較之單克隆抗體具有更強的治療作用及更少的副作用，且穩定性更強。

本研究結果顯示，srhIL-4R組大鼠嗜酸性粒細胞等細胞數量較模型組明顯減少，進一步證實，本次實驗成功表達的活性srhIL-4R重組蛋白在預防和治療哮喘中具有一定作用，為哮喘患者的臨床免疫靶向治療提供一定的前期工作基礎，具有較大的參考價值。

［1］Zavorotinskaya T，Tomkinson A，Murphy JE.Treatment of experimental asthma by long-term gene therapy directed against IL-4 and IL-13［J］.Mol Ther，2003，7（2）：155-162.

［2］張勇，王渭池，李元.人可溶性白介素-4受體（sIL-4R）在大腸桿菌中的表達和純化［J］.中國生物化學與分子生物學報，2004，20（6）：778-784.

［3］龔萍.大鼠哮喘模型的改良與評價［D］.中南大學，2010.

［4］Taehdjian R，Mathias C，Alkhatib S，et al.Pathogenicity of a disease associated human IL-4 receptor allele in experimental asthma［J］.J Exp Med，2009，206（10）：2191-2204.

［5］楊光勇，郭海濤，何光志.白細胞介素-4及其受體的研究現狀［J］.浙江中西醫結合雜志，2014，9（24）：843-845.

［6］張婉瑩，姜曉峰，梁紅艷，等.支氣管哮喘的細胞因子治療進展［J］.國際免疫學雜志，2012，35（1）：64-66.

［7］Nishikubo K，Murata Y，Tamaki S，et al.A single administration of interleukin-4 antagonistic mutant DNA inhibits allergic airway inflammation in a mouse model of asthma［J］. Gene Ther，2003，10（26）：2119-2125.

（收稿：2015-11-07 修回：2015-12-23）

Recombinant Soluble Human Interleukin-4 Receptor Protein Inhibiting Rat Asthma Model

YANG Guangy-ong,GUO Haitao,LIU Ximing,HE Guangzhi,TIAN Weiyi,CAI Kun,WANG Ping,LIANG Jiandong,WANG Wenjia,HAN Jie. Department of BasicMedical Sciences,Guiyang Collegeof Traditional ChineseMedicine, Guiyang(550002),China

ObjectiveTo investigate the effect of recombinant soluble human interleukin-4 receptor（srhIL-4R）in the asthma model.MethodsThe Homo sapiens（human）interleukin-4 receptor gene was synthesized according to the sequence of the GenBank（XM_005255309）,the synthesis of gene fragment was cloned into pET-28a（+）vector to construct the recombinant expression vector pET-28a（+）-srhIL-4R.The expression plasmid was induced into E.coli BL21（DE3）and expression strain was selected,the recombinant was analyzed by SDS-PAGE and Western-blotting.Rat using an ovalbumin（OVA）-induced model of allergic asthma was conducted with the recombinant soluble human interleukin-4 receptor proteins,and lung tissue from model of allergic asthma was taken for pathology observation.Results500bp-750bp target fragment was obtained by restricted enzyme,SDS-PAGE and western-blotting analysis results of the recombinant protein was about 25 kDa.Compared with model group,allergic asthma intervention decreased significantly in inflammatory cells.ConclusionSrhIL-4R has a certain effect in the prevention and treatment of asthma.

rat;asthma model;recombinant soluble human interleukin-4 receptor;recombinant proteins

2011年貴州省社會發展科技攻關項目[No.黔科合SY字（2011）3020]；2014年度貴陽中醫學院“2011協同創新中心”和貴州省委組織部高層次人才科研條件特助經費項目（No.TZJF-2011年28號）

貴陽中醫學院基礎醫學院（貴陽 550002）

何光志，E-mail：heguangzhi7711@sina.com；Tel：13809430436