子宮內(nèi)膜異位癥在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)及腺上皮細(xì)胞高純度分離培養(yǎng)技術(shù)的改進(jìn)

余莎，謝梅青

（1.廣東省深圳市第二人民醫(yī)院 婦科，廣東 深圳 518000；2.中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510120）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosos, EMs）體外模型是研究其發(fā)病機(jī)制及探討新的治療方法的工具。模型可分為兩種，一種是在體模型，還有一種是離體模型。由于人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞及腺上皮細(xì)胞還沒(méi)成功建立體系，因此，原代培養(yǎng)成為了EMs的重要體外研究方法。現(xiàn)今，和腺上皮以及宮內(nèi)膜間質(zhì)分離培養(yǎng)的相關(guān)文獻(xiàn)非常的多[1]，但未檢索到比較EMs在位子宮內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜分離培養(yǎng)方法差異的文獻(xiàn)。本研究的目的是對(duì)EMs患者在位子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行高純度分離、培養(yǎng)，從而對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)方法做出改進(jìn)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料及子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本的獲取

隨機(jī)選取2007年7月-2012年3月在深圳市第二人民醫(yī)院及中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科住院治療的手術(shù)患者共12例，年齡25～40歲，分為EMs組和正常組。EMs組選擇有不孕癥史的因子宮腺肌病或卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫手術(shù)治療的患者7 例，所有病例均經(jīng)腹腔鏡或開腹手術(shù)確診，分期不限；正常組選擇已正常生育的非子宮內(nèi)膜異位癥、非子宮內(nèi)膜病變及非惡性腫瘤的入院手術(shù)患者5例。所有患者術(shù)前3個(gè)月未使用激素類藥物，行腹腔鏡術(shù)之前，通過(guò)患者的陰道取樣，或者直接對(duì)切除的子宮進(jìn)行刮取，將采集的子宮內(nèi)膜立刻置于無(wú)菌的5 ml磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline, PBS）離心管中，并且轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室，在低溫下進(jìn)行分離培養(yǎng)。經(jīng)術(shù)后病理檢查，患者的子宮內(nèi)膜都沒(méi)有發(fā)生病變，獲取子宮內(nèi)膜樣本及所需操作均在術(shù)前取得患者同意。

1.2 主要試劑及儀器

D-MEM/F-12培養(yǎng)基及膠原酶I（Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶以及多孔板等（Corning公司）；倒置顯微鏡（Leica公司，DMi1），400目不銹鋼篩網(wǎng)（博理醫(yī)療儀器有限公司），立可靈一次性宮腔組織吸引管（上海家寶醫(yī)學(xué)保健科技有限公司，C3.1型），二氧化碳（CO2）細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司，3429型），低速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠，DT5-1B）；小鼠抗人波形蛋白單抗、小鼠抗人角蛋白單抗、即用型鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（streptavidin-biotin-peroxidase complex method, SABC）免疫組化染色試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺3（3'-diaminobenzidine, DAB）（武漢博士德公司）。

1.3 方法

1.3.1 子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞的分離及培養(yǎng) ①在無(wú)菌操作的條件下，使用PBS液清洗子宮內(nèi)膜，共計(jì)3次；除去血塊及黏液，將子宮內(nèi)膜組織剪成大小約為0.5～1.0 mm3碎塊。②加入2.5～5.0 倍體積的0.1%膠原酶I，混勻37℃水浴60～120 min（EMs組標(biāo)本120 min，正常組標(biāo)本60～90 min）。③經(jīng)步驟②處理后，使用規(guī)格為38 mm的過(guò)濾網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，并且把濾液以1 000 r/min的速度進(jìn)行離心，時(shí)長(zhǎng)為5 min。經(jīng)離心處理后，摒棄上層清液，下層的沉淀主要成分為間質(zhì)細(xì)胞；把過(guò)濾網(wǎng)上殘留的物質(zhì)進(jìn)行漂洗并收集，然后進(jìn)行離心處理，摒棄上層清液，下層的沉淀主要成分為腺上皮細(xì)胞團(tuán)。④ 使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，將混有間質(zhì)細(xì)胞的沉淀液以5×105/ml接種于加有培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。再將混有腺上皮細(xì)胞團(tuán)的沉淀液以400 個(gè) / cm2接種于加有培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。⑤EMs組間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)本在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)30 min，正常組間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)本在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)45～60 min之后，摒棄懸浮在上方的腺上皮細(xì)胞和細(xì)胞，再次分別將培養(yǎng)液加入其中。⑥正常組腺上皮細(xì)胞標(biāo)本在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)120～150 min，EMs組腺上皮細(xì)胞標(biāo)本在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)90～120 min，之后吸出懸浮在上層的腺上皮細(xì)胞團(tuán)和細(xì)胞，并且將其轉(zhuǎn)移到加有培養(yǎng)液的新培養(yǎng)瓶中或直接種到6孔板及24孔板中。⑦置于CO2體積分?jǐn)?shù)為5%并且溫度為37℃的孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)1 d后更換培養(yǎng)液，之后每隔2、3 d再更換1次。

正常組子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)主要參照唐雪蓮[2]的方法，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)EMs組子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)進(jìn)行了如下改良：相比正常組，延長(zhǎng)EMs組消化時(shí)間30～60 min（步驟②），縮短了其后的貼壁等待時(shí)間約15～30 min（步驟⑤、⑥）。

1.3.2 子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)與純度鑒定 ①將細(xì)胞置于倒置顯微鏡下，觀察上述細(xì)胞的形態(tài)學(xué)差異。②用小鼠抗人波形蛋白單抗、小鼠抗人角蛋白單抗對(duì)腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞分別進(jìn)行免疫染色，操作按照說(shuō)明書進(jìn)行。其中小鼠抗人波形蛋白單抗、小鼠抗人角蛋白單抗的工作濃度均為1∶100。

1.3.3 子宮內(nèi)膜腺上皮及間質(zhì)細(xì)胞的傳代 原代細(xì)胞鋪滿瓶底后，進(jìn)行傳代，向瓶?jī)?nèi)加入0.125%胰酶加0.02%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA），室溫下消化2 min，加入含10%胎牛血清的D-MEM/F-12培養(yǎng)基終止反應(yīng)。用吸管將細(xì)胞自瓶底吹下并使其呈均勻混懸液。將細(xì)胞懸液以1 000 r/min離心5 min，棄去上清，加入含10%胎牛血清的D-MEM/F-12培養(yǎng)基，將細(xì)胞吹勻，按1傳3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

12例子宮內(nèi)膜標(biāo)本中10例培養(yǎng)成功，2例培養(yǎng)失敗。其中，1例是因?yàn)榧?xì)菌污染所致，1例是因?yàn)榧?xì)胞量過(guò)少所致。經(jīng)原代培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞，在接種1 d之后，基本能貼壁。接種4～7 d，腺上皮細(xì)胞鋪滿；接種3～7 d間質(zhì)細(xì)胞鋪滿，細(xì)胞存活率≥90%。

2.2 對(duì)間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的觀察

EMs組間質(zhì)細(xì)胞貼壁較快，約15 min后開始逐漸貼壁；正常組約30 min后開始貼壁，2 h后大部分貼壁；EMs組和正常組子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞在體外生長(zhǎng)時(shí)外觀特征相似。兩組間質(zhì)細(xì)胞均呈梭形，紡錘狀，折光性強(qiáng)，胞質(zhì)薄而透明，核橢圓，長(zhǎng)期培養(yǎng)后細(xì)胞延伸為長(zhǎng)梭形，相互平行排列成束。兩組原代培養(yǎng)的間質(zhì)細(xì)胞純度相當(dāng)高，幾乎見(jiàn)不到腺上皮細(xì)胞團(tuán)，偶見(jiàn)的小團(tuán)樣生長(zhǎng)腺上皮細(xì)胞經(jīng)傳代1、2代亦可去除純化。間質(zhì)細(xì)胞易被傳代，生存期長(zhǎng)，10代以內(nèi)其形態(tài)基本不變。

2.3 對(duì)腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的觀察

EMs組腺上皮細(xì)胞團(tuán)貼壁較快，約90 min后開始逐漸貼壁；正常組約2 h后開始貼壁，24 h后均貼壁良好。EMs組和正常組子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞在體外生長(zhǎng)時(shí)外觀特征相似。兩組腺上皮細(xì)胞胞質(zhì)飽滿，核大圓，核仁明顯，細(xì)胞多數(shù)形態(tài)為星形、多角形，形狀不規(guī)則，呈旋渦狀成團(tuán)生長(zhǎng)。腺上皮細(xì)胞團(tuán)中偶見(jiàn)間質(zhì)細(xì)胞插入性生長(zhǎng)，較散在。培養(yǎng)瓶中腺上皮細(xì)胞約占細(xì)胞總數(shù)92%～98%。兩組腺上皮細(xì)胞均能傳1、2代，傳代后細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。

2.4 消化時(shí)間及貼壁時(shí)間不同對(duì)兩組細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在使用膠原酶I消化兩組細(xì)胞時(shí)，正常組標(biāo)本消化60～90 min，正常組的子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞可以達(dá)到較好的分離效果，但是，如果采用與正常組相同的消化時(shí)間EMs組只能得到數(shù)量很少的腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞（少于正常組的30%）。考慮消化時(shí)間不夠，延長(zhǎng)EMs組標(biāo)本消化120 min后，間質(zhì)細(xì)胞及腺上皮細(xì)胞純度增加。

正常組間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)本在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)45～60 min之后，間質(zhì)細(xì)胞純度較高。如果采用與正常組相同的貼壁時(shí)間，EMs組只能得到純度較低的間質(zhì)細(xì)胞（混有較多的腺上皮細(xì)胞）。考慮貼壁時(shí)間較長(zhǎng)，一部分腺上皮也已貼壁。故減少培養(yǎng)時(shí)間，EMs組間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)本在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)30 min之后，間質(zhì)細(xì)胞純度明顯提高。

正常組腺上皮細(xì)胞標(biāo)本在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)120～150 min之后，間質(zhì)細(xì)胞基本全部貼壁，懸浮液中腺上皮純度較高。如果采用與正常組相同的貼壁時(shí)間，EMs組只能得到數(shù)量很少的腺上皮細(xì)胞。考慮貼壁時(shí)間較長(zhǎng)，大部分腺上皮細(xì)胞也已貼壁，懸浮液中腺上皮細(xì)胞剩余較少。故減少培養(yǎng)時(shí)間，EMs組腺上皮細(xì)胞標(biāo)本在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)90～120 min，腺上皮細(xì)胞數(shù)量明顯提高。

2.5 細(xì)胞純度鑒定

對(duì)EMs組子宮內(nèi)膜細(xì)胞使用改進(jìn)后的分離培養(yǎng)方法后，分別取得EMs組間質(zhì)細(xì)胞及腺上皮細(xì)胞原代細(xì)胞。用對(duì)腺上皮細(xì)胞特異的細(xì)胞角蛋白單克隆抗體標(biāo)記腺上皮細(xì)胞，對(duì)間質(zhì)細(xì)胞特異的波形蛋白單克隆抗體標(biāo)記間質(zhì)細(xì)胞，原代培養(yǎng)的EMs組腺上皮細(xì)胞角蛋白染色陽(yáng)性，純度率約95%；原代培養(yǎng)的EMs組間質(zhì)細(xì)胞行波形蛋白染色呈陽(yáng)性反應(yīng)，細(xì)胞純度率可達(dá)97%以上。

3 討論

子宮內(nèi)膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)，其生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍具有二倍體遺傳物性。體外原代培養(yǎng)EMs患者的在位以及異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞，能夠?qū)⒓?xì)胞在組織原位信息，當(dāng)作是研究子宮內(nèi)膜細(xì)胞的代謝、分化以及生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停軌驗(yàn)楫愇话Y的臨床研究與治療提供依據(jù)。根據(jù)經(jīng)血逆流致病學(xué)說(shuō)，發(fā)生EMs的組織是子宮內(nèi)膜。有學(xué)者指出，體外培養(yǎng)子宮內(nèi)膜細(xì)胞，實(shí)際上是模擬EMs[3]。經(jīng)研究證實(shí)，對(duì)子宮異位患者的內(nèi)膜進(jìn)行體外培養(yǎng)，內(nèi)膜細(xì)胞的生化活性以及內(nèi)膜細(xì)胞和在為內(nèi)膜細(xì)胞的相似；和異位子宮的內(nèi)膜細(xì)胞相比較，在為子宮的內(nèi)膜細(xì)胞更容易獲取足夠的標(biāo)本量，所以，利用EMs患者在位子宮的內(nèi)膜進(jìn)行分離培養(yǎng)，所得到的間質(zhì)細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞可以當(dāng)做EMs的體外模型。

關(guān)于子宮內(nèi)膜間質(zhì)及腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)有較多文獻(xiàn)報(bào)道[4-7]，但子宮內(nèi)膜異位癥在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)參考文獻(xiàn)不多[8]，并且未檢索到比較正常子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜異位癥在位子宮內(nèi)膜分離培養(yǎng)方法差異的文獻(xiàn)。在現(xiàn)有關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)的報(bào)道中，細(xì)胞純度尤其是腺上皮細(xì)胞純度不高[9-12]。雖然譚先杰等[13]報(bào)道的方法分離兩種細(xì)胞純度較高，但操作步驟復(fù)雜，4次篩網(wǎng)分離及用牛血清白蛋白梯度離心的方法增加了污染的可能性。李傲等[14]報(bào)道將膠原酶的濃度提高，用量加大，可提高兩類細(xì)胞的產(chǎn)量。這里筆者參考唐雪蓮等[2]的子宮內(nèi)膜簡(jiǎn)易分離法并加以改進(jìn)。在實(shí)驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)EMs組子宮內(nèi)膜消化時(shí)間需長(zhǎng)于正常組，同時(shí)前者兩種細(xì)胞貼壁均快于后者。Klemmt等[15]也發(fā)現(xiàn)EMs患者在位及異位子宮內(nèi)膜較正常子宮內(nèi)膜的黏附能力增加。在同樣的處理時(shí)間60～90 min下相比正常組，EMs組用膠原酶消化不夠完全，仍然有較大的組織塊存在，增加后續(xù)的分離困難。而當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間至120 min后，內(nèi)膜組織消化較完全。EMs組分離間質(zhì)細(xì)胞時(shí)，若采用正常組的貼壁時(shí)間45～60 min因已有部分腺上皮細(xì)胞貼壁而致純度下降；分離腺上皮細(xì)胞時(shí)，若采用正常組的貼壁時(shí)間120～150 min因腺上皮細(xì)胞貼壁快而在之后的上清液中所剩無(wú)幾，故筆者采取了延長(zhǎng)EMs組的消化時(shí)間（較正常組長(zhǎng)30～60 min），并減少其后的貼壁等待時(shí)間（較正常組減少15～30 min），使盡可能少的腺上皮細(xì)胞貼壁而純化間質(zhì)細(xì)胞；多放培養(yǎng)皿增加接觸面積，使在較短貼壁時(shí)間內(nèi)（較正常組減少30～60 min）盡可能多的間質(zhì)細(xì)胞貼壁和盡可能少的腺上皮細(xì)胞貼壁從而獲得盡可能多的腺上皮細(xì)胞。分離過(guò)程簡(jiǎn)便，按不同貼壁時(shí)間分離獲得的EMs組和正常組的腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞純度及活性均高，可作為子宮內(nèi)膜異位癥在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)方法的改進(jìn)。

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