附睪微環境對精子成熟影響的研究進展

龔 堅綜述 劉朝圣審校

1.湖南中醫藥大學2013級碩士研究生（長沙　410208）；2.湖南中醫藥大學中西醫結合學院

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附睪微環境對精子成熟影響的研究進展

龔 堅1綜述 劉朝圣2審校

1.湖南中醫藥大學2013級碩士研究生（長沙410208）；2.湖南中醫藥大學中西醫結合學院

20世紀60年代Bedford［1］和Orgebin-Crist［2］根據實驗結果，提出了附睪精子成熟的理論，睪丸產生精子并不成熟，缺乏運動和精-卵結合能力，精子在附睪中的成熟不是自發和時間依賴的，而是通過與附睪蛋白相互作用來完成的。研究表明，不僅附睪分泌蛋白參與精子成熟過程，而且是附睪內多種因素共同作用于附睪精子促使精子成熟。附睪精子和睪丸精子妊娠實驗結果表明，睪丸精子組種植率及妊娠率低于附睪精子組，可能與睪丸精子缺乏成熟、影響胚胎進一步發育有關［3］，進一步驗證了附睪微環境對精子成熟的影響。本文就精子成熟過程中附睪微環境的影響進行了文獻綜述。

一、精子在附睪內成熟

睪丸中產生的精子從其形態結構和染色質的角度已基本成熟，但還不具備運動能力，精卵識別以及牢固的結合能力。精子在附睪中的成熟是一個高度程序化的過程，一方面受到精子自身因素的作用，另一方面則受到了附睪微環境的影響。精子在附睪移行過程中，精子各部分也在發生著一系列的變化，如精子胞質小滴的移行，胞漿、頂體等精子的形態發生了進一步的變化；精子核染色質的濃縮，對核酸酶的抵抗力增強；精子膜的膜脂、膜蛋白、膜上糖基成分、膜電荷以及膜流動性與通透性的改變；精子運動能力、受精能力的獲得；異常的精子逐漸被吞噬、吸收或降解等［4， 5］。精子從睪丸到附睪經歷了一系列的物理、化學和形態的改變，從而最終獲得完全成熟。

二、附睪內影響精子成熟的因素

（一）附睪分泌蛋白與精子成熟

現今對附睪精子成熟的研究已深入到分子生物學水平，熱點是與附睪精子成熟微環境相關的一些特異性蛋白表達及基因調節的研究。目前己知附睪可以分泌約200種蛋白質［6］，其中一些蛋白已被確認直接參與了附睪中精子的成熟，但它們中的大多數在雄性生殖中的作用還未明了。這些蛋白質與管腔液的其他成分形成不斷變化著的管腔微環境，與精子相互作用，使精子表面蛋白的成分得以部分改變或部分修飾，從而被激活或抑制從而逐步獲得成熟時所具備的功能。

1. 附睪分泌蛋白與精子運動能力的獲得：精子的運動能力是在附睪成熟過程中獲得并得到發展的，包括超激活運動和前向運動。

有研究表明，附睪特異分泌蛋白EPPIN表達與精子濃度、精子活力呈顯著負相關，它能結合精囊蛋白（semenogelin， Sg）和纖連蛋白（fibronectin，Fn），通過在精子表面形成的外殼蛋白抑制精子獲能及精子的活動性［7］。其中，EPPIN-Sg可以調控精子內部的pH值及鈣離子水平，進而抑制精子的活動率，影響生殖［8， 9］。體外模型研究證明，前向運動蛋白（FMP）是未成熟精子在附睪內成熟獲得前向運動的必需蛋白［10］，當FMP結合在附睪精子的尾部時，精子能獲得前向運動能力，當FMP結合在附睪精子頂體時，能防止精子間的頭部凝集［11］。有報道，中性α-糖苷酶活性與精子活力之間有顯著的正相關性，與不運動精子有顯著的負相關性，因此推測其與精子前向運動能力有關［12］；其可能的機制是中性α-糖苷酶可催化精子糖原降解，供給精子代謝與運動能源。此外β-防御素15［13］、β-防御素3（HBD-3）［14］參與精子活力和前向運動能力發生，在附睪內精子成熟方面發揮重要作用。

2. 附睪分泌蛋白與獲能、頂體反應、精卵結合：精子獲能是指精子在獲得穿透卵子透明帶能力的生理過程，是精子在受精前必須經歷的一個重要階段；頂體反應是指精子釋放頂體酶，穿過透明帶的過程。精子質膜上有一些具黏附作用的蛋白參與到精子獲能、頂體反應以及其后的精卵融合過程過程中，存在于精子和卵子上的蛋白質復合物具有結合和融合作用，一些附睪分泌的精子結合蛋白參與了這個過程。

附睪分泌蛋白P34H大多與精子膜頂體部位結合，可作為附睪精子成熟的標志物，能夠介導精子和透明帶的結合，當附睪中P34H降低時可發生原發性男性不育［15］。精卵聚合蛋白通過與卵質膜的相互作用，破壞卵質膜的穩定性，促使精子穿卵過質膜，完成受精［16］。附睪特異蛋白絲氨酸蛋白酶抑制劑（HongrES1）特異地表達于附睪尾段，在附睪精子移行時結合到精子頂體前區，精子獲能使HongrES1蛋白脫落，頂體反應后完全消失，起到去能因子的作用［17， 18］。此外，人附睪蛋白SOB2，FLB1，gp20， Ecad等也參與了精卵融合過程。

3. 附睪分泌蛋白與免疫保護及抗菌能力：附睪分泌的蛋白中，有些能夠結合在精子表面，保護精子在男性和女性生殖道內免受細菌或病毒的攻擊，從而促進精卵作用，在附睪精子成熟過程中發揮重要作用；防御素家族就是其中的代表。

防御素家族成員Bin1b特異地表達于附睪頭部，能與精子頭部結合；在對成長中大鼠的研究發現，30d的大鼠附睪才發現Bin1b的表達，在性成熟時表達量達到高峰，老年時逐漸減少。這種區域特異性和發育階段特異性的表達方式提示Bin1b在精子成熟和生育方面可能有重要作用。而利用附睪頭部上皮細胞的原代培養物和反義實驗已證實了Bin1b的抗微生物作用［19］。防御素家族其他成員如：HE2［20］，EP2［21］和ESC42［22］也被證實具有較強的抗細菌、抗真菌作用。

hCAP18是一種在附睪從頭部到尾部全程表達的分泌蛋白，是Cathelicidin家族成員，大量的表達于附睪尾部。已證實hCAP18具有強大抗菌作用［19］。同樣在附睪尾部大量分泌的Lf蛋白，是一種金屬轉運蛋白，通過限制微生物攝取這些金屬離子而發揮強大的抗菌、抗真菌、抗病毒效應，同時還具有抗腫瘤和抗炎癥作用［19］。

4. 附睪分泌蛋白與抗氧化保護蛋白：哺乳動物的精子多富含不飽和脂肪酸，因而極易受到氧自由基的損傷。附睪分泌的抗氧化損傷的物質可以保護附睪管腔內移行成熟和儲存的精子。

附睪管腔液中谷胱甘肽（GSH）介導的保護作用在附睪內是很活躍的，通過對谷胱甘肽過氧化物酶5基因敲除小鼠模型的研究表明，谷胱甘肽過氧化物酶5是一種重要的管腔液自由基清除者，保護尾部精子自由基損傷，維持精子DNA完整性，保障男性生育能力［23， 24］。肉堿及其酯類是附睪中另一種活躍的抗氧化物質，它能通過兩種途徑發揮其抗氧化作用：一條途徑是通過阻止活性氧（ROS）產生，清除自由基，保護精子細胞免遭氧化損傷［25］。另一條途徑是通過清除細胞內過多的乙酰輔酶A，或替代進入質膜磷脂中的脂肪酸，以及增加花生四烯酸的分解代謝，從而有效發揮其抗氧化和修復作用［26-27］。

（二）附睪內細胞因子與精子成熟

附睪內的細胞因子是由睪丸間質的巨噬細胞受到外界刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物活性的小分子蛋白質，通過與受體結合等途徑在附睪內參與精子的發育與成熟［28］。

由T細胞產生的巨噬細胞移動抑制因子（MIF）具有垂體激素、免疫調節劑和分裂素等功能。研究發現MIF作為一種附睪上皮細胞因子大量存在于附睪中，參與精子在附睪中的成熟過程，可能與附睪精子獲得運動能力有關［29-31］。肝細胞生長因子（HGF）在附睪的體部及尾部能高度表達，它對附睪精子的受精能力和運動能力的啟動有著重要作用；研究發現，它參與附睪精子的運動能力的獲得［32］。

（三）微量元素與精子成熟

微量元素能通過多種途徑影響精子的生成、成熟；有研究表明，不育癥患者精漿中微量元素含量與精液參數存在密切的相關性［33］。其中，附睪中的鋅離子、鈣離子對附睪精子成熟影響最大。

1. 鋅離子： 附睪中一些促進精子成熟的酶是鋅金屬酶，鋅缺乏可導致這些酶功能異常。有研究表明，精漿中鋅離子含量與精子頂體酶活性呈正相關；因此，鋅離子能通過對精子頂體酶活性的作用影響精子成熟過程［34］。而另一種鋅金屬酶：山梨糖醇脫氨酶，可將山梨醇轉化為果糖為精子提供能量，因此，山梨糖醇脫氨酶活性與精子運動性相關［35］。可見附睪中鋅離子含量對精子成熟有著重要作用。

2. 鈣離子：已有研究表明精子的Ca2+聚集作用對精子成熟、獲能和頂體反應起主導作用，進而直接影響雄性受精和生育力［36， 37］。附睪特異肽Bin1b通過激活鈣離子通道促進Ca2+吸收，引發未成熟精子獲得運動能力［38， 39］。實驗證明Bin1b通過激活精子L型Ca2+通道，進而為未成熟精子獲得運動力提供必需的Ca2+匯集，Ca2+與精子鞭毛中的鈣調蛋白相互作用激活磷酸二酯酶，降低精子內cAMP的濃度，從而調控精子活力［40-41］。

（四）其他

1. 活性氧：氧的代謝產物及其衍生物的含氧物質統稱為活性氧類（Reactive Oxygen Specie，ROS），包括超氧陰離子、過氧化氫、羥基自由基、單線態氧和一氧化氮等。在生殖系統中，ROS的產生是一種正常生理情況。附睪微環境中適量活性氧可以調節精子功能， 研究表明，適當水平的ROS在精子生理學方面起著重要作用，如O2-、H2O2和NO與精子高活躍性運動、獲能以及頂體反應有關，ROS引起的脂質過氧化作用促進透明帶結合［42］。但過多活性氧會導致氧化應激發生，造成精子質膜不飽和脂肪酸氧化，嚴重影響精子質膜流動性，危害精子獲能、精卵識別和受精過程，同時破壞精子DNA和魚精蛋白之間緊密包裝狀態，引起 DNA 斷裂，堿基缺失，父方遺傳信息完整性無法保障，常引起不育或者圍產期流產［43］。

2. 酸性環境：近年來有研究表明，無論是基因突變還是環境因素所導致的附睪管腔酸性環境的破壞均可引起精子成熟障礙和雄性不育。因此，附睪管腔內pH值改變可以影響精子的成熟［44-45］。當精子進入女性生殖道后，在獲能過程中，位于質膜上的精子特異性Ca2+通道1（CatSper1）促進Ca2+的內流，使得精子尾部呈“鞭打”運動，CatSper1的激活依賴于堿性環境，而附睪管腔內酸性環境以及HCO3-的濃度則會阻滯CatSper1的激活，阻止精子在附睪的提前獲能［46］。附睪上皮細胞通過各種酸堿轉運體調節HCO3-的重吸收和質子的分泌，共同維持了附睪管腔酸性微環境的平衡，為附睪精子成熟提供了適合的環境。

結　語

近年來隨著研究的深入，越來越多的影響附睪精子成熟的因子及機制被發現，附睪與避孕及男性不育的關系也顯得越來越重要。盡管對附睪內環境的附睪分泌蛋白、細胞因子、微量元素等作用機制的研究取得了一定的進展，但還有許多問題尚未解決。有別于傳統對睪丸精子研究的重視，隨著附睪微環境對精子成熟影響研究的深入，將為以附睪為目標的男性不育防治及男性生育調控方法提供基礎理論依據。

致謝：本文由湖南省科技計劃項目（2012SK3138），國家自然科學（81373641）項目資助。

關鍵詞附睪； 微環境； 精子成熟； 細胞因子；附睪分泌蛋白

doi∶10.3969/j.issn.1008-0848.2016.02.017

參 考 文 獻

1Bedford JM . Hum Reprod 1994； 9（11）∶ 2087-2199

2Orgebin-Crist MC. J Reprod Fertil Suppl 1998； 53∶ 285-92

3管群， 于艷， 張琪瑤， 等. 中華醫學會生殖醫學分會.中華醫學會生殖醫學分會人類精子庫管理學組第三屆年會全國男性生殖醫學和精子庫管理新進展第四次研討會論文匯編. 中華醫學會生殖醫學分會 2012∶ 4.

4Axner E .Theriogenology 2006； 66（1）∶ 14-24

5Jones R. In∶ Robaine and Hinton（eds）. The epididymis∶from molecules to chinical practice. Kuluwer Academic/ Plenum Publishers 2002∶405

6Zhou CX， Zhang YL， Xian L， et al. Nat Cell Biol 2004； 6（5）∶458-464

7 Zhang X， Fang J， Xu B， et al. PLoS One 2013； （12）∶e82600

8O'Rand MG， Widgren EE， Beyler S， et al. Biol Reprod 2009； 80（2）∶ 279-285

9O'Rand MG， Widgren EE. Biol Reprod 2012； 86（2）∶ 55

10Majumder GC， Dey CS， Haldar S， et al. Arch Androl 1990； 24（3）∶ 287-303

11Serres C， Kann ML. Reprod Nutr Dev 1984； 24（1）∶ 81-94

12Elzanaty S，Malm J，Giwercmen A. Hum Reprod 2005；20（1）∶ 221-225

13Zhao Y， Diao H， Ni Z， et al.Cell Mol Life Sci 2011； 68（4）∶697-708

14刁瑞英， 牟麗莎， 陳浩， 等. 深圳中西醫結合雜志 2014；24（5）∶ 1-4， 封3

15Legare C， Thabet M， Picard S， et al. Biol Reprod 2001；64（2）∶ 720-727

16Cuasnicu PS， Ellerman DA， Cohen D J， et al. Arch Med Res 2001； 32（6）∶ 614-618

17Zhou Y， Zheng M， Shi QX， et al. PLoS One 2008； 3（12）∶e4106

18Ni Y， Zhou Y， Chen WY， et al. Mol Reprod Dev 2009；76（10）∶ 984-993

19程桂芝， 李建遠. 國外醫學·計劃生育/生殖健康分冊2006； 25（4）∶ 224-228

20Yenugu S， Hamil KG. Biochem J 2003； 372（Pt 2）∶ 473-483

21Avellar MC， Honda L， Hamil KG. Biol Reprod 2004；71（5）∶ 1453-1460

22Yenugu S， Hamil KG， Radhakrishnan Y. Endocrinology 2004； 145（7）∶ 3165-3173

23Chabory E， Damon C， Lenoir A， et al. J Clin Invest 2009；119（7）∶ 2074-2085

24Aitken RJ， De Iuliis GN. Mol Hum Reprod 2010； 16（1）∶3-13

25Dokmeci D. Folia Med（Plovdiv） 2005； 47（1）∶ 26-30

26Vicari E， Calogero AE. Hum Reprod 2001； 16（11）∶ 2338-2342

27Pignatelli P， Lenti L， Sanguigni V. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2003； 284（1）∶ H41-H48

28熊承良， 吳明章， 劉繼紅， 等. 武漢∶ 湖北科學技術出版社， 2002∶ 182-190

29Eickhof R， Wilhelm B， Renneberg H， et al. Mol Med 2001； 7（1）∶ 27-35

30 Frenette G， Legare C， Saez F， et al. Mol Hum Reprod 2005； 118（5）∶ 575-582

31Crali C， Leclerc P， Metz CN， et al. Fertil Steril 2007；88（4 Suppl）∶ 1240-l247

32Geisberg JV， St ruhl K. Nucleic Acids Res 2004； 32（19）∶e151

33鄭利平， 朱旭， 覃堅， 等. 國際檢驗醫學雜志 2012；33（6）∶ 659-660

34邴晏如， 莫和國， 黃健云， 等. 國際檢驗醫學雜志 2014；35（13）∶ 1708-1709

35Elzanaty S， Malm J. J Androl 2007； 28（6）∶ 847-852

36Guraya SS. Int Rev Cytol 2000； 199∶ 1-64

37Breitbart H. Mol Cell Endocrinol 2002； 187（1-2）∶ 139-144

38 von Horsten HH， Derr P， Kirchhoff C. Biol Reprod 2002； 67（3）∶ 804-813

39Zhou CX， Zhang YL， Xiao LQ， et al. Nat Cell Biol 2004；6（5）∶ 458-464

40謝淑武， 孫祖越， 曹霖. 生殖與避孕 2006； 26（2）∶ 99-103

41周宗瑤， 王一飛. 生殖與避孕 2003； 23（4）∶ 238-243

42楊欣， 顏志中. 浙江醫學會男科學分會.2005年浙江省男科學學術會議論文匯編. 浙江省醫學會男科學分會2005∶ 4

43Lanzafame FM ， La Vignera S， Vicari E， et al. Reprod Biomed Online 2009； 19（5）∶ 638-659

44Yeung CH， Breton S， Setiawan I， et al. Mol Reprod Dev 2004； 68（2）∶ 159-168

45Pastor-Soler N， Pietrement C， Breton S. Physiology （Bethesda） 2005； 20∶ 417-428.

46Kirichok Y， Navarro B， Clapham DE. Nature 2006；439（7077）∶ 737-740

（2015-11-11收稿）

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