干細胞治療腦出血后神經功能損傷的臨床研究進展

郭現利張俊義王建軍王少勃張立欣

1.內蒙古醫科大學，內蒙古呼和浩特 010110；2.內蒙古醫科大學附屬鄂爾多斯市中心醫院，內蒙古鄂爾多斯 017000

干細胞治療腦出血后神經功能損傷的臨床研究進展

郭現利1，2張俊義2▲王建軍2王少勃2張立欣2

1.內蒙古醫科大學，內蒙古呼和浩特 010110；2.內蒙古醫科大學附屬鄂爾多斯市中心醫院，內蒙古鄂爾多斯 017000

腦出血常常造成神經細胞的壞死與凋亡，嚴重影響患者預后功能。對于腦出血的臨床治療常常為保守或手術清除血腫。然而對于神經細胞的損失臨床治療常常不能很好的解決。干細胞，特別是神經干細胞具有自我更新和多向分化潛能。其為神經損失修復帶來了希望。本文從腦出血后內源性及外源性神經干細胞移植治療的臨床效果及潛在機制進行綜述，為研究腦出血提供參考。

干細胞；腦出血；修復；移植

隨著建筑及公共交通的不斷發展，顱腦創傷的發病率呈上升趨勢。我國是發展中國家，顱腦創傷的形勢也十分嚴峻。隨著臨床及基礎研究的不斷深入，人們對顱腦創傷的機制及治療有了長足的進展。臨床藥物不斷更新，手術方式不斷改進，在治療重度顱腦創傷方面也取得了一定的成績。但此類患者后續的功能恢復常常存在一些問題和不足。干細胞是近年來研究較多的細胞之一，他被認為具有多向分化潛能，能夠修復多種組織損傷。干細胞用于動物及人體顱腦創傷的修復也有很多報道，本文就干細胞治療腦出血后神經功能損傷的臨床研究做一綜述，為今后的干細胞治療顱腦創傷提供臨床參考。

1 腦出血治療現狀

在我國腦出血占全部腦卒中的20%～30%，急性期病死率為30%～40%，幸存患者中大部分有輕度到重度的殘疾，極大的降低了患者的生活質量，同時也給家庭和社會帶來沉重負擔[1]。腦出血是腦部自發性的、非外傷性的出血進入腦實質內，形成血腫，誘發腦水腫和局部炎癥，使神經元和神經膠質細胞受到嚴重的傷害，導致腦細胞凋亡，所以腦出血后語言及肢體活動能力、認知學習記憶能力受到極大影響，功能恢復異常困難。臨床治療腦出血，傳統方法多為改善腦部血液循環、營養腦神經、康復鍛煉以及手術清除血腫等對癥治療，效果均不甚理想。現在研究發現，干細胞治療腦出血取得了一定的效果[2]。干細胞具有自我更新能力，它同時還能夠分化為多種細胞類型，其增殖速度也比成體細胞快，在一定環境刺激下，能夠做出反應。多種來源的干細胞移植治療腦出血均是安全的，且均可改善腦出血帶來的各種神經功能損害[3]。

2 干細胞種類及作用

2.1 干細胞種類

干細胞治療腦出血主要分為兩個方面：（1）內源性干細胞；（2）外源性干細胞。

內源性干細胞治療作用：研究證實，在多種動物的側腦室壁，海馬齒狀回和室管膜下區均能否分離培養出神經干細胞（NSCs）。以往人們普遍的認識是中樞神經系統缺乏再生和修復的能力。然而近年來的研究表明：內源性NSCs可在腦組織受到一定程度損失時被激活，激活的NSCs具有增殖潛能強，遷移距離遠，可向神經細胞分化[4]，所以腦出血后神經功能可部分恢復，不過受損的神經元數量較多時，被激活的NSCs可能無法補充受損神經元的丟失。最終神經功能不能很好的修復。因此臨床常常需要外源性擴增的干細胞進行系統治療。

外源性干細胞的治療作用：目前臨床常用的外源性干細胞包括：骨髓源性間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）、神經干細胞（neural stem cells，NSCs）、臍源性間充質干細胞、臍帶間充質干細胞和胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）等。

2.2 干細胞作用

神經干細胞：NSCs是一類具有強大自我更新、增殖及分裂潛能的干細胞。NSCs可通過不對稱細胞分裂方式，產生神經元、膠質細胞及神經元前體細胞，進而組成功能性腦組織。NSCs可在多種組織中分離培養獲得，例如哺乳動物神經組織及早期胚胎等。NSCs在體內外局部微環境調節下，可直接分化為神經細胞和膠質細胞，通過分泌神經營養因子調節細胞功能，減少恢復時間和提高功能恢復[4]；同時還與損傷周圍區域的細胞具有同源性，具有較大的臨床治療價值。理論上NSCs被認為是腦出血治療最為理想的種子細胞。然而NSCs較難獲得、獲取的量較少及倫理問題，其在臨床實驗及應用上受到了一定限制。

骨髓間充質干細胞：BMSCs研究較多也較早，它也具有良好的多向分化潛能。在一定條件的刺激下BMSCs可以分化為神經細胞。與NSCs不同的是，BMSCs來源較為豐富，體外培養擴增快，并且具有自體移植，無免疫排斥反應等優點，移植后與宿主大腦整合并長期存活，能夠轉染和表達外源性基因，能夠通過血腦屏障，并促進小膠質細胞形成等特性。朱建新等[5]將腦出血患者血腫清除后，將自體BMSCs注入血腫腔的周圍，對移植后的神經功能進行連續的評價，患者的神經功能和活動能力均顯著改善。Tian等[6]發現自體骨髓間充質干細胞移植能改善患者神經功能缺損程度并提高日常生活活動能力。王萬宏等[7]證實，自體骨髓間充質干細胞可降低腦出血患者血清中的GFAP、S100β水平，改善腦出血患者神經組織損傷修復。

臍源性干細胞：臍源性MSCs是在臍帶及臍帶血中分離培養而來，有持續增殖及多向分化的潛能。有報道稱臍帶源性MSCs富含造血、間充質、神經及內皮等多種干/組細胞，更傾向于向內胚層及神經系統方向分化[8]，且細胞原始移植后很少發生抗宿主反應、增殖和多向分化能力強、收集過程相對簡單無創、病毒感染概率小、不受年齡的限制、無道德倫理問題、易于工業化制備等優點，使臍源性干細胞成為細胞治療最理想的種子來源。袁進國等[9]發現，來源于臍帶中的間充質干細胞體外培養后移植治療腦出血后遺癥，無特殊不良反應，配合綜合康復治療患者各項功能均表現出良好的臨床恢復效果。李秀云等[10]將人臍血分離培養的MSCs注入到26例的腦出血患者的蛛網膜下腔中，經過半年的隨訪發現，23例腦出血患者干細胞治療后神經功能評分均較治療前顯著提高，3例無明顯療效。

胚胎干細胞：ESCs是一種全能分化細胞，囊胚中分離培養出ESCs。ESCs在體外可以無限增殖并且能夠分化成為骨細胞、皮膚細胞、成纖維細胞等多種組織來源的細胞[11]。在一定生物和化學條件的激勵下，ESCs甚至能分化為前體神經細胞，并能逐漸分化為具有功能的神經元細胞，以及多種類型的神經膠質細胞。胚胎來源神經干細胞被認為是腦出血治療最具有前景的細胞來源之一，然而其致瘤性較其他干細胞高，并且倫理問題較復雜，因此其臨床應用也受到很大限制。盧旺盛等[12]在局部麻醉的下，采用立體定位技術，將源自健康母體自然流產的胎兒的神經干細胞植入病變區域，隨訪結果發現術后6個月，患者臨床癥狀改善率達到了81.25%。劉士東等[13]同樣也對顱內血腫患者在清除血腫后植入胚胎干細胞，患者術后第3個月的運動功能吞咽功能等均有改善。

3 干細胞治療腦出血的不同移植方式、治療時間

3.1 移植方式

干細胞體內移植可通過以下四種方式實現：（1）靜脈滴注、頸內動脈內注入移植；（2）立體定向靶點注射；（3）側腦室干細胞移植；（4）蛛網膜下腔穿刺注射。然而靜脈輸入的方式最適合臨床應用，因為其侵襲性最小，但可能存在干細胞播散全身多個器官，及潛在肝臟毒性，造成到達腦組織損傷部位的細胞數量急劇減少，并且靜脈滴注過快有引起一過性腦缺血和栓塞等危險。立體定向靶點注射有一定的侵襲性，易損傷局部正常腦組織，注入腦實質可很快產生占位副作用，并且局部干細胞濃度過高，不利于分化，患者不易接受，限制了其臨床推廣。侵襲性較小的方式還有蛛網膜下腔移植，這種方式能有效逃避血腦屏障的阻隔，每次治療移植細胞數量也相對少，但易感染及繼發顱高壓風險。

3.2 移植時間

目前研究表明移植的多種干細胞在各種腦出血模型中均能成活并發揮作用，但至今尚沒有系統性分析研究關于移植時間對功能恢復的影響。關于干細胞治療腦出血的時機亦有不同觀點。

（1）急性期干預：急性期腦組織損傷后，損傷區域會迅速分泌的各類炎性介質、興奮性毒性神經遞質，甚至產生大量氧自由基等，影響干細胞正常生存的微環境，限制了干細胞的存活、增殖和分化潛能；其次腦出血急性期損傷部位血循環障礙，以及急性期神經營養因子分泌水平較低，也極大的影響干細胞移植成功率。同時又有學者認為：腦出血早期，腦組織本身存在內源性修復機制，且能夠在早期發揮一定作用[14]。有報道顯示腦出血1d后植入NSCs顯示出較好的存活率。徐德才等[15]采用大鼠腦出血成模后第48小時移植BMSCs，結果顯示，細胞移植后可明顯改善大鼠腦出血后神經功能的恢復，認為BMSCs治療大鼠腦出血的一個重要潛在機制是其顯著減輕損傷腦組織周圍早期炎癥反應，晚期移植可能效果欠佳。

（2）亞急性期干預：有研究認為急性期成活率低于亞急性期或晚期，Haas等[16]發現卒中后3周左右進行細胞移植，移植的細胞存活率最高。楊郁野等[17]認為：腦出血造成出血區域的神經遞質、微環境發生劇烈變化，一些炎癥因子及氧自由基等對移植進去的干細胞存活不利，故建議對患者進行血腫引流，待引流充分，拔除引流管前進行移植。

（3）恢復期干預：在恢復期可以避免急性期毒性神經遞質及自由基等物質對干細胞的損傷，故選擇在腦出血病程第2～6個月進行移植，結果證實在此時間窗進行移植，療效確切肯定。輕度到重度的顱腦創傷半年以內均可以進行神經干細胞移植，多個研究表明其臨床效果良好。此外，移植時間窗的選擇必須考慮到腦損傷的自然恢復過程，刻意延長移植的等待時間，可能使得病灶處膠質瘢痕增生明顯，影響干細胞有效的遷移至損傷區域，但是最晚移植時間尚需進一步探討。

在細胞移植的過程中，移植的細胞數量也是臨床需要考慮的一個重要因素。將1×106和2×106個MSCs經尾靜脈分別注入大鼠體內發現，2×106移植組大鼠運動功能顯著優于1×106移植組，這也提示MSCs細胞移植數量也影響著治療效果。

4 干細胞移植治療腦出血已知和可能的機制

關于干細胞移植如何修復腦功能損傷，其機制至今仍不確定，可能這些因素相關：（1）替代及修復作用：移植后激活內源性神經干細胞增殖并分化為神經元標志的細胞，外源性干細胞受到周圍微環境誘導而增殖，分化。分化成與神經細胞類似的細胞形態和功能，逐漸替代丟失的神經細胞并參與神經功能修復重建，甚至同原有神經細胞建立起功能性突觸聯系。（2）分泌多種神經生長促進因子：干細胞移植在損傷腦組織局部能條件性的分泌多種神經生長促進因子，包括堿性成纖維細胞生長因子、血管內皮細胞生長因子、腦源性神經生長因子等。還能通過促進血管新生，增加損傷區域的血流供應，為受損組織和神經元提供氧氣和營養物質。（3）抗炎和免疫調節作用：將脂肪來源的MSCs用來治療大鼠腦出血，結果顯示損傷灶炎癥反應在很早期就有明顯減輕，髓過氧化物酶+性細胞數在出血灶周圍腦組織中顯著減少。

5 干細胞治療腦出血的優勢和面臨的問題

雖然目前研究顯示干細胞移植在腦出血治療方面臨床效果明顯，但是臨床實際操作中仍然存留許多問題有待解決：如干細胞的來源、移植部位、移植時機、移植途徑、移植細胞數量、如何有效穩定地激活內源性NSCs改善神經功能等沒有統一規范，且干細胞移植治療腦出血的遠期療效和潛在風險均有待于進一步評估。李計成等[18]將20例患者的自體骨髓間充質干細胞通過蛛網膜下腔注射方式行移植，在移植前和移植后180天采用NIHSS評分和日常生活活動能力Barthel指數對患者神經功能缺損程度進行評價，同期隨訪血常規、生化全項、腫瘤標記物等，發現使用自體骨髓間充質干細胞在腦出血臨床治療方面療效有效，安全性好，近期臨床效果顯著，而遠期臨床效果還有待進一步的隨訪研究。2例患者在移植后出現一過性發熱，這可能與單核巨噬細胞釋放致熱源有關，還有可能的原因則是無菌操作流程的問題。將患者自體骨髓間充質干細胞先在體外誘導成神經干細胞，然后誘導的細胞移植到原手術區腦軟化灶與正常腦組織交界處以及腦軟化灶的中央部位，并行顱骨修補，結果接受治療的3例患者語言功能、偏癱側肢體運動功能都有好轉，尤其是偏癱測肢體的肌張力較前明顯降低，干細胞腦移植患者顱腦MRI圖像也表明腦軟化灶有縮小趨勢，并且干細胞移植區未見“成瘤”[19-20]。有研究將胚胎干細胞用于治療腦出血，患者在移植后有出現發熱等不良反應，但都通過休息和對癥治療后完全恢復。有學者用自體骨髓間充質干細胞治療腦出血，其中有一個患者僅CA-153略有升高，因此干細胞移植以后的短期內的臨床治療效果得到了證實，但遠期效果有待更長時間的隨訪研究[21]。

[1] 賈建平.神經病學[M].第6版.北京：人民衛生出版社，2008：187-192．

[2] Mcallister TW.Neurobiological consequences of traumatic brain injury[J].Dialogues Clin Neurosci，2011，13（3）：287-300．

[3] 王磊，王連仲.神經干細胞與脊髓損傷的治療[J].中國組織工程研究與臨床康復，2008，12（12）：2335-2338.

[4] BonnerJ F，Blesch A，Neuhuber B，et al.Promoting directional a xon growth from neural progenitors grafted into the injured spinal cord[J].J Neurosci Res，2010，88（6）：1182-1192．

[5] 朱建新，李忠民，肖太武，等.自體骨髓間充質干細胞移植治療腦出血32例[J].中國組織工程研究與臨床康復，2010，146（4）：159-162．

[6] Tian F，Yamashita T，Deguchi K，et al.In vivo opticai imaging correlates with improvement of cerebral ischemia treated by intravenous bone marrow stromal cells (BMSCs) and edaravone[J].Neurol Res，2013，35（10）：1051．

[7] 王萬宏，王亞林，盧慶韜.自體骨髓間充質干細胞移植對腦出血患者血清S100β、GFAP的影響[J].中國實驗診斷學，2014，12（18）：2011-2013．

[8] Park HW，Lim MJ，Jung H，et al.Human mesenchymal stem cell-derived Schwann cell-like cells exhibit neurotrophic effects，viadist in ctgrowth factor production，in amodel of spinal cord injury[J].Glia，2010，58（9）：1118-1132．

[9] 袁進國，馮斌，曹藏柱，等．臍帶間充質干細胞移植并康復治療腦出血后遺癥1年隨訪[J].中國組織工程研究，2012，16（14）：2656-2660．

[10] 李秀云，張國華.臍血干細胞移植治療腦出血的療效分析[J].中華全科醫學，2011，9（11）：1724-1725．

[11] Trounson A.Human embryonic stem cell：mother of all cells and tissue Types[J].Reprod Biomed online，2001，4（Suppll）：58-63．

[12] 盧旺盛，田增民，趙全軍，等．立體定向神經干細胞移植治療腦出血后遺癥療效分析[J].中華神經外科疾病研究雜志，2008，21（6）：58-62．

[13] 劉士東，寧佩佩，張慶華．胚胎干細胞移植治療腦出血后遺癥療效觀察[J].醫學綜述，2011，17（12）：1098-1099．

[14] 劉建新，王曉峰，張榮軍，等．經枕大池移植神經治療重型顱腦損傷大鼠的實驗研究[J].臨床神經外科雜志，2012，9（3）：133．

[15] 徐德才，張少軍，婁飛云，等.骨髓間充質干細胞移植治療腦出血大鼠的實驗研究[J].臨床神經外科雜志，2014，11（3）：200-203．

[16] Haas S，Weidner N，Winkler J.Adult stem cell therapy in stroke[J].Curropin Neurol，2005，18（1）：59-64．

[17] 楊郁野，張宏義，于明月.自體骨髓單個核細胞移植治療腦出血近期臨床療效及對神經功能恢復的影響[J].中國老年學雜志，2014，9（34）：4838-4839．

[18] 李計成，李曉明，戴如飛，等.自體骨髓間充質干細胞移植治療腦出血的療效觀察[J].中國實用神經疾病雜志，2012，15（20）：8-10．

[19] Lee HJ，Kim KS，Kim EJ，et al.Brain transplantation of immortalized human neural stem cells promotes functional recovery in mouse intracerebral hemorrhage stroke model[J].Stem Cells，2007，25（5）：1204-1212.

[20] Chen J，Tang YX，Liu YM，et al.Transplantation of adipose-derived stem cells is associated with neural differentiation and functional improvement in a rat model of intracerebral hemorrhage[J].CNS Neurosci Ther，2012，18（10）：847-854.

[21] Sgubin D，Aztiria E，Perin A，et al.Activation of endogenous neural stem cells in the adult human brain following subarachnoid hemorrhage[J].J Neurosci Res，2007，85（8）：1647-1655.

Progress in clinical research of stem cells in the treatment of nerve function injury after intracerebral hemorrhage

GUO Xianli1,2ZHANG Junyi2WANG Jianjun2WANG Shaobo2ZHANG Lixin2
1.Inner Mongolia Medical University,Hohhot,010110,China;2.Erdos Central Hospital Affiliated to Inner Mongolia Medical University,Erdos 017000,China

Cerebral hemorrhage often causes necrosis and apoptosis of nerve cells,which has serious influence to outcome function of patients.The clinical treatment of cerebral hemorrhage is usually conservative or surgical removal of hematoma.However,it is not a good solution to control the clinical treatment of nerve cell loss.Stem cells,in particular, neural stem cells have self renewal and multi differentiation potential,which brings hope to the repair of nerve damage.This article reviews the clinical effect and potential mechanism of endogenous and exogenous neural stem cell transplantation in the treatment of cerebral hemorrhage to provide reference for the study of cerebral hemorrhage.

Stem cell;Cerebral hemorrhage;Repair;Transplantation

R277.7

A

2095-0616（2016）21-45-04

2016-09-02）

▲通訊作者