天然反義轉錄物及其在神經膠質瘤中的功能

朱麗媛，彭小忠

(中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院，生物化學與分子生物學系/醫學分子生物學國家重點實驗室，北京 100005)

天然反義轉錄物及其在神經膠質瘤中的功能

朱麗媛，彭小忠Δ

(中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院，生物化學與分子生物學系/醫學分子生物學國家重點實驗室，北京 100005)

天然反義轉錄物(natural antisense transcripts，NATs)被定義為在自然狀態下生物體內產生的內源性RNA，其通常是通過與靶分子進行序列互補而形成天然的正義-反義轉錄物配對的雙鏈RNA。NATs普遍存在于原核和真核生物中，可以在轉錄水平、轉錄后水平、翻譯水平等多個層次經由不同機制調節基因的表達。此外，NATs也與惡性腫瘤的發生發展密切相關，一些NATs在正常組織與神經膠質瘤組織中的表達存在顯著差異。NATs可能成為神經膠質瘤診斷、預后以及治療效果的一種新的標志物，同時NATs也是潛在的新的膠質瘤基因治療的靶點。本文對NATs的分類及其在神經膠質瘤中的功能及可能的機制做具體闡述。

天然反義轉錄物(NATs)；神經膠質瘤；癌癥

1 天然反義轉錄物的生物學本質

1.1 NATs的定義 反義RNA(antisense RNA，AS-RNA)指的是與特定DNA或RNA互補結合的轉錄本，是自然條件下存在于生物體內的一類與靶標轉錄本轉錄方向相反、序列互補的內源性RNA分子，可與正義靶RNA通過堿基互補配對方式形成雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)發揮功能。1977年Timmons等[1]利用寡核苷酸合成的方法合成了AS-RNA，但此后發現天然反義轉錄物(natural antisense transcripts，NATs)廣泛存在于原核和真核生物中，并能以非編碼RNA的形式發揮作用[2-4]。事實上，人源和鼠源NATs分別占各自整個基因組的約22%和29%[5]。值得注意的是，NATs可以是蛋白編碼基因，也可以是非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)，據統計，在人類基因組中這種正義-反義配對轉錄本最普遍的存在形式是正義蛋白編碼基因-反義ncRNA組合[6]。現如今，關于NATs的鑒定有多種方法，例如基因表達的連續分析、cDNA序列分析、Northern雜交、鏈特異性逆轉錄PCR、電子雜交、基因芯片等技術。NATs作為一種豐富的生物分子資源，在生命過程中具有重要的調控功能。

1.2 NATs的分類 根據NAT對其靶基因作用部位的不同，可以分為順式NAT(cis-NAT)和反式NAT(Trans-NAT)[7]。cis-NATs的轉錄起源于靶基因基因座位的負鏈DNA，即來自基因組同一位點相反鏈上的轉錄；而trans-NATs轉錄自與靶基因不同的基因座位。cis-NAT通常情況下與靶基因重疊且序列完全互補，可以相對特異地調控正義靶基因的表達；trans-NAT作用于不同基因座位序列不完全互補的靶基因，并可以作用于多個不同正義轉錄物，形成復雜的調控網絡[8]。

根據NATs與靶基因的重疊位點和程度，cis-NAT主要分為頭對頭重疊、尾對尾重疊和完全重疊這3種形式。頭對頭(head to head，5’-5’)重疊是指NATs的5’端序列與正義靶基因5’端序列互補(包括5’UTR區、外顯子和內含子)；尾對尾(tail to tail，3’-3’)重疊是指配對正義和反義轉錄本3’端序列互補(包括3’UTR區、外顯子和內含子)，尾對尾重疊是最普遍存在的順式NAT。以上2種均屬于不完全重疊形式；而完全重疊方式是指反義NAT與正義靶基因序列完全互補[5]；此外近來研究還發現有非重疊NATs[9-10]。

根據配對轉錄本互補區域的編碼性質，發生序列重疊的轉錄本可以是2個蛋白編碼基因、1個蛋白編碼基因和1個ncRNA，或者2個都是ncRNAs。因此NATs可以分為編碼-編碼、編碼-非編碼和非編碼-非編碼3類形式。在人類基因組中，最普遍存在的形式為反義RNA是ncRNA，正義RNA是蛋白編碼基因的NAT配對組合，其約占全部正/反義基因對(sense/antisense pair) 的50%[5]。

根據NATs轉錄本片段長度不同，NATs可分為短鏈NATs和長鏈NATs。以200核苷酸(nucleotide，nt)為界，長度超過200 nt的NATs被稱為長鏈NATs或反義LncRNA；短于200 nt的NATs被稱為短鏈NATs。長鏈NATs在結構上與mRNA具有一些相似特點，如具有5’帽子結構等；但也有不同之處，譬如：有些長鏈NATs的3’端不具有多聚腺苷酸尾巴；長鏈NATs被發現也可以定位于核內[11]。修飾方式和亞細胞定位的不同決定了其可以通過不同的機制來調控正義靶基因表達。

1.3 NATs在神經系統的調控作用 在真核生物中，NATs廣泛參與了基因組印記、RNA干擾、翻譯水平調節、選擇性可變剪接、X染色體失活和RNA編輯等多種調控過程。NATs在真核細胞中可以表達在胞核，也可以在胞漿，其介導的調控可發生在基因表達從轉錄到翻譯的任何環節[12]，可以在轉錄、RNA/蛋白加工或核質轉運等不同水平調節靶基因的表達[13]。

NATs在生物體內普遍存在，在哺乳動物神經系統的表達尤為豐富，其對神經系統正常生理功能有重要調節作用。首先，許多NATs是中樞神經系統特異表達，因此NATs會參與腦皮質發育和髓鞘形成，在神經元形成過程，如神經干細胞(NSCs)自我更新和分化中起重要調節作用[14]。腦源性神經營養因子(BDNF)在中樞神經系統的發育過程中發揮重要作用，BDNF-AS為保守的反義lncRNA，通過抑制BDNF-AS，可提升BDNF的表達從而誘導神經元生長和分化[15-16]。此外，NATs還可以參與到神經元突觸形成和可塑性調控，神經顆粒素(NRGN)在大腦皮層、海馬和紋狀體神經元胞體和樹突中呈高表達，調控突觸后信號轉導通路，可以降低在記憶強化早期調控因子CaMK II的活性。NATs也參與離子通道和神經元興奮性調控，如最近研究顯示從大鼠背根神經節(DRG)初級感覺神經元中發現了鉀離子通道Kcna2 RNA互補的反義RNA[17]，Kcna2-AS參與調控神經病理疼痛的誘導和維持過程。

鑒于NATs在中樞神經系統的重要生理性調控作用，其異常改變可能導致神經系統疾病，隨著NATs功能研究的深入，其很可能作為神經系統疾病診斷的新型生物學標志物或潛在的治療靶點。目前來講，NATs在神經系統疾病的研究主要集中在神經變性病，如阿爾茨海默病[18]、帕金森病[19]和亨廷頓病[20]等，NATs通過參與調控基因表達及一些重要信號轉導通路來介導這些疾病的發生和發展，后續對NATs分子機制的研究將有助于人們更好地理解神經系統疾病的發病機理，為治療疾病提供新的理論基礎和潛在的藥物靶點。

2 原癌性NATs在神經膠質瘤中的功能

在腫瘤中，大部分基因組發生了表觀遺傳改變如去甲基化，轉錄噪音增加可能引起反義轉錄物的轉錄產生，進而調控關鍵抑癌基因功能，最終導致腫瘤惡性轉化。有統計闡明，反義轉錄物在腫瘤中所占的比例比正義轉錄物更高[16]，說明反義轉錄物在腫瘤發生發展中所起到的功能是極其重要的。最新研究表明，NATs在組織中的差異表達與人類腫瘤的發生發展過程密切相關，因此，NAT的異常表達成為腫瘤研究中的重要考慮因素。目前已經證實αHIF[21]、survivin[22]、gfg-1[23]、p15AS[24]、rTSα等NAT分子能夠直接作用于多種不同腫瘤相關的關鍵基因，NATs與靶基因異常表達導致了腫瘤的發生、發展。

中樞神經系統腦膠質瘤(glioma)約占原發性顱內腫瘤的40%～50%，是中樞神經系統中最常見的腫瘤。對于神經膠質瘤，傳統的治療手段包括手術治療、放療和化療。由于膠質瘤呈浸潤性生長，腫瘤組織與周圍正常腦組織界限不清，手術難以全切，效果不佳，復發率高。腫瘤細胞產生的放化療抵抗造成放療和化療效果的降低，過度的放化療容易對中樞神經系統產生毒性作用，因此神經膠質瘤的治療效果及預后均較差。探索膠質瘤治療的新途徑，尤其是從基因水平闡明膠質瘤的發生、發展和演變機理，尋找有效的基因治療的靶點是神經外科研究的熱點，也是有效治療膠質瘤亟待解決的艱巨任務。

近幾年的相關研究表明，NATs在膠質瘤的生長、增殖以及遷移侵襲等過程中具有重要調控功能。腫瘤抑制基因p15是一種與白血病有關的周期素依賴性蛋白激酶抑制劑，在p15基因座位上轉錄生成的反義RNA p15AS表達水平正好與p15相反，即在p15高表達的組織或細胞中，p15-AS表達水平下調；并且在調控機制方面，p15AS是通過形成異染色質而非DNA的甲基化來導致p15基因表達沉默的[24]。TSLC1作為腫瘤抑制基因，通常在許多腫瘤中被甲基化下調，包括神經膠質瘤、神經母細胞瘤、肺癌、鼻咽腫瘤、惡性黑色素瘤、食管癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、大腸癌、子宮頸癌和前列腺癌。而TSLC1的反義轉錄本TSLC1-AS1作為lncRNA家族成員之一，可以促進TSLC1的表達，從而抑制腫瘤的增殖、遷移能力，反之亦然[25]。可見，NATs在調控膠質瘤發生發展過程中起到重要的功能。

反義核酸技術是基因治療中比較有特色的方法之一。在設計并實施這項技術時，首先針對在腫瘤發生發展進程中起重要作用的經典癌基因或抑癌基因的突變體以及自分泌生長因子及其受體基因，設計出其反義核酸序列；之后根據序列進行合成并注入體內，以此在轉錄或翻譯水平抑制或下調異常基因的表達，達到阻斷腫瘤細胞內異常信號傳導的目的，使腫瘤細胞通過被抑制生長或誘導凋亡轉入正常軌道。目前臨床上已經針對膠質瘤發生發展起重要作用的癌基因(如c-myb[26]，c-myc[27])，用反義核酸來封閉以達到治療的目的。自分泌生長因子及其受體的反義封閉在膠質瘤治療中也有重要作用。目前已經成熟的有bFGF[28]、TGF-β2[29]、VEGF[30]反義RNA等有效治療方法。后續基因治療靶點的篩選研究會更加豐富反義核酸治療技術。天然反義轉錄物治療膠質瘤的前景比較廣泛，可以將其與多種生物治療以及傳統的放療和化療密切結合，可能會為膠質瘤治療帶來新的生機。

3 NATs的調控機制和調控網絡

3.1 NATs調控基因表達的分子機制 真核生物中基因表達調控及細胞信號傳導是極為復雜精密的網絡，迄今為止，NATs在這一網絡中參與的調控機制主要有轉錄干擾、RNA封閉、依賴雙鏈RNA機制和反義誘導的甲基化(染色質重建和修飾)等[16]。在具體的調控過程中，NATs可以直接以cis-或者trans-的方式與正義靶基因通過堿基互補配對發揮作用, 也可通過影響靶基因的轉錄、突變、RNA/蛋白運輸和翻譯等過程中的靶點來影響基因表達[31-32]。NATs對靶基因表達的調控作用是以互補結合成雙鏈配對RNAs為前提的，通過RNA編輯[33]、RNA干擾[34]、RNA封閉[35]和轉錄干擾[36]等方式來實現。NATs啟動子區會結合一些經典的核心轉錄因子[37]，在某種生理刺激下，這些NATs和他們相應的正義靶基因可能發生競爭結合相同的轉錄因子，提示NATs和他們的正義靶基因可以在特定細胞或組織中共表達或成反比表達[38]。此外，NATs與DNA甲基化和組蛋白修飾等表觀遺傳學調控之間也存在直接的聯系[39]。

隨著后基因組和功能基因組的研究逐漸深入，用系統的科學實驗技術和生物信息學分析來闡明NAT真正的生物學意義，可以為理解人類反義RNA(antisense RNA，AS)的特性提供新的認識，有關NATs新的作用分子機制的發現甚至可以為了解人類多種疾病的發生發展進程提供新的視角和科學依據。

3.2 基因、NATs和microRNAs構成的調控網絡 NATs，siRNA和microRNAs在作用機制上都是通過序列互補與靶分子結合形成雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)來調節靶基因的表達。但是，NATs生成后可以直接與靶基因結合影響其表達；并且NATs的作用機制有好多種，靶點包括mRNA和蛋白質分子；NATs除了對靶基因產生抑制效應，還可以促進靶基因的表達；如果說microRNA主要微調細胞的分化和生物體組織的生長發育過程，siRNA是作為一種生物自身的基因免疫機制，那么NATs主要是調控對維持生物體正常生理功能有重要作用的關鍵基因的表達，NATs對個體生命活動的調控更加普遍和深入。

眾所周知，microRNA是一類單鏈小非編碼RNA，長約22nt，通常情況下通過與靶mRNA的5’或3’ UTR完全或不完全互補結合，引起mRNA的降解或翻譯抑制。而在特定情況下，NATs可以與正義靶基因配對結合，通過封閉microRNA在同一靶基因上的結合位點來增加mRNA半衰期，維持正義轉錄物的穩定性，延長其RNA活性。例如，BACE1-AS可以在胞漿中通過封閉miR-485-5p的作用靶點維持BACE1 mRNA的穩定性[18]。microRNA也可以通過反義lncRNA來間接影響mRNA的功能，如，小腦退化相關蛋白1(CDR1)，其NAT形式是一種選擇性剪接后的非線性環形外顯子RNA，可以通過直接結合來增加CDR1 mRNA的穩定性，核內miR-671依賴Ago來降解CDR1-AS從而使其表達下調，伴隨CDR1 mRNA表達的減少[40]。因此，NATs不僅作為重要的調控因子來影響整個基因表達的生命過程，而且可以與microRNA和靶基因等分子構成作用網絡，在整個調控環路中發揮不可或缺的功能。

4 結語

目前已知真核生物多個物種中都存在NATs的廣泛表達，并且NATs對生物的組織生長發育和相關疾病的發生發展有重要的調控作用。各個物種基因組和轉錄組的分析為NATs的研究提供了充足的原始數據。后續對NATs的研究應更多地放在其自身表達調控機制中，隨著CAGE(cap analysis of gene expression)技術的出現，更多NATs被發現其轉錄的原始位置。NATs本身的表達也存在時空差異，具有不同模式，表明其是受其它調控因子的嚴格調控。對于NATs上游以及下游因子的功能及機制探索對未來的生命科學領域乃至醫學臨床領域都將是重大的突破，從而鑒定出新的診斷標記和藥物靶標。

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(編校：吳茜)

Natural antisense transcripts and the functional role in gliomagenesis

ZHU Li-yuan, PENG Xiao-zhongΔ

(State Key Laboratory of Medical Molecular Biology; Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100005, China)

Natural antisense transcripts (NATs) are reverse-complementary at least in part to the sequences of other endogenous sense transcripts and regulate the expression of their target genes. NATs, considered until recently as transcriptional noise, are a very common phenomenon in human and eukaryotic transcriptomes. Otherwise, they play an indispensible functional role in organ formation, cell differentiation, diseases and pathology. NATs have been shown to regulate nearly every level of gene regulation: pre-transcriptional, transcriptional and post-transcriptional, through DNA-RNA, RNA-RNA or protein-RNA interactions. Glioma is a kind of brain tumor with high incidence and lethality. Recently, it had been reported the profile of NATs in glioma and indicate many NATs which were dysregulated. The roles of NATs in gliomagenesis were primarily characterized and we discovered some significant findings about maker molecules. In this review, we summarized the research on the function of oncogenic NATs in glioma and made some detail for mechanism.

natural antisense transcripts (NATs); glioma;cancer

國家自然科學基金(31301151)

朱麗媛，女，博士在讀，研究方向：NAT參與膠質瘤發生發展，E-mail：zly_smile@126.com；彭小忠，通信作者，男，博士，教授，研究方向：神經系統發育和疾病分子機制，E-mail：pengxiaozhong@pumc.edu.cn。

R982

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.01