內毒素在小鼠肝癌發生過程中的作用

韓殿冰　曾本華　葛成果

1)河南汝州市人民醫院肝膽外科　汝州　467500； 2)第三軍醫大學實驗動物研究所　重慶　400000；

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內毒素在小鼠肝癌發生過程中的作用

韓殿冰1)曾本華2)葛成果3)

1)河南汝州市人民醫院肝膽外科汝州467500； 2)第三軍醫大學實驗動物研究所重慶400000；

資料表明，微生物在癌癥的發生中起著重要作用，例如幽門螺桿菌是引起胃癌發生的重要因素[1]，人類乳頭狀瘤病毒是引起宮頸癌的重要因素[2]，特異性的細菌感染是引起結直腸癌的重要因素[3]。但細菌是否也是引起肝癌的重要因素及細菌的代謝產物內毒在肝癌的發生中起到何種作用，均為今后臨床需關注的問題。

1材料與方法

1.1主要試劑二乙基亞硝銨(N-Nitrosodiethylamine,DEN)、脂多糖和抗內毒素IgY(Immunoglobulin yolk，IgY；北京百靈威科技有限公司)。內毒素(LPS E.Coli0111:B4；美國Sigma公司)。內毒素測定所用試劑盒(上海伊華臨床醫學科技公司)。

1.2動物分組和模型建立6周齡BaLB/C無菌雄性小鼠20只，購于第三軍醫大學實驗動物所，普通6周齡BaLB/C雄性小鼠20只，購于鄭州大學實驗動物中心。無菌小鼠飼育于無菌隔離器中，飼養環境為20 ℃～23 ℃，濕度為40%～70%，12 h光照，12 h黑暗。飼料和墊料均經過60Co-γ50kGy射線輻照滅菌，飲水、鼠籠和飲水瓶等經過高溫高壓滅菌后傳進無菌隔離器。10只無菌小鼠自由飲用濃度為0.01%的DEN液(A組)，另10只無菌小鼠在飲用同樣濃度DEN液的同時，每日腹腔注射一次脂多糖(0.1 mg/kg)(B組)。10只普通小鼠飲用同樣濃度的DEN液(C組)，另10只普通小鼠在飲用同樣濃度DEN液的同時，每日腹腔注射一次抗內毒素IgY(1.6 mg/kg)(D組)。

1.3血漿內毒素水平測定眼眶采血，分離血漿，按照試劑盒的方法用定量鱟試劑測定法檢測血漿內毒素水平。

2結果

2.1肝癌發生率誘癌18周后，停用所有藥物24 h，第2天所有小鼠剖腹取肝臟，對懷疑肝癌的部位取肝組織做病理切片，結果肝癌發生率A組為0(0/9)，B組為66.7%(6/9)，C組為77.8%(7/9)，D組為12.5%(1/8)(表1，圖1)。取病理前，A、B、C、D四組小鼠分別死亡1、1、1、2只小鼠，死亡時間均發生在誘癌后的3～4周，死亡小鼠取病理未發現肝癌，考慮為DEN液中毒死亡。

2.2腫瘤數量發生肝癌的肝臟，肝癌常是散在多發，數目2～8個不等。其中C組9只小鼠發生肝癌數量最多，共有31個，各組肝癌數量見表1。

2.3腫瘤大小肝癌一般較小，多為米粒大小，直徑2.6～16 mm，各組肝癌平均直徑見表1。

2.4肝/體比肝臟重量與小鼠自體重量的比值，C組最高為11.3%，A組最低為5.2%，各組肝/體比見表1。

表1　血清內毒素水平和肝癌發生情況

注：*與C組比較，P<0.01；#與B組比較，P<0.01；$與C組比較，P>0.05；Δ與D組比較，P<0.01。

2.5血清內毒素水平肝癌發生率較高的B組和C組內毒素水平最高，肝癌發生率較低的A組和D組內毒素水平最低。

2.6血清內毒素與肝癌發生情況的相關性各組的內毒素水平與腫瘤數量、平均腫瘤直徑呈顯著正相關(r=0.875、0.812，P均<0.01)。

1A:A組肝臟有散在的細小結節，但沒有發現肝癌

1B:B組肝臟細小結節數量較多，多數動物出現肝癌，常有多個肝癌病灶并存于一個肝臟

1C:C組肝癌的發生率最高，常有多個肝癌病灶并存于一個肝臟

1D:D組肝癌發生率較低，該肝臟有兩個肝癌病灶。

圖1誘癌18周后各組肝臟的情況

3討論

資料表明[4]，誘發性肝癌動物模型中，以誘癌劑二乙基亞硝胺(DEN)的誘癌成功率較高，對肝臟致癌有較好的專一性，且大部分癌變為肝細胞癌，是目前應用較廣泛的一種誘發性肝癌模型。

在致癌物的作用下腸道菌群的變化能誘發肝癌[5]，腸道有菌小鼠有很高的肝癌發生率，而腸道無菌小鼠極少出現肝癌[6]。我們的實驗表明，無菌小鼠(不僅僅腸道無菌)口服致癌物DEN后，未出現一例肝癌，而普通小鼠有很高的肝癌發生率，結合上面的資料，可以認為，細菌在肝癌的發生過程中起重要作用。該實驗表明。實驗之初也曾想過，由于無菌動物的免疫力低下，理論上講，無菌小鼠應該更容易成癌，現在看來免疫力的高低不是引起肝癌的根本原因。

細菌在肝癌的發生過程中起重要作用，細菌的代謝產物內毒素(一種脂多糖)在其中起何種作用。為此我們給無菌小鼠腹腔注射內毒素，同樣喂食致癌物DEN液。18周后發現，無菌小鼠也誘導出肝癌，肝癌發生率與普通有菌小鼠的肝癌發生率相近，而且腫瘤數量、平均腫瘤直徑和肝/體比等均無明顯差異。抗內毒素IgY作為LPS的特異性多克隆抗體，可有效拮抗LPS的生物學效應[7]。本實驗中，對有菌小鼠腹腔注射抗內毒素IgY同樣喂食DEN液后，只有一只小鼠產生肝癌。內毒素水平的檢測也同樣表明，在內毒素水平最高的B組和C組，肝癌發生率最高。而內毒素水平最低A組和D組，肝癌發生率最低。統計學的相關性分析表明，各組內毒素水平與腫瘤數量、平均腫瘤直徑呈顯著正相關。上述結果均表明，表面層次上看細菌是引起肝癌的重要因素，但不能排除細菌代謝產物內毒素為引起肝癌的根本原因之可能。

部分文獻報道，[8]致癌物DEN在肝臟的代謝過程中引起DNA損傷，導致肝癌發生。但本次觀察發現，DEN在誘發肝癌的過程中必須有內毒素的參與，沒有內毒素的參與，單獨DEN難以誘發肝癌，因此不排除內毒素在DEN 誘發肝癌的過程中起到重要作用，但其作用機理尚不清楚。

該實驗還發現在DEN誘發肝癌的過程中，無論是否產生肝癌，無菌動物肝臟的硬化程度較重而有菌動物的硬化程度較輕(圖1)，發生此現象原因尚不清楚，有待進一步研究。

總之，本研究表明，沒有細菌，就不會發生肝癌，而不排除細菌代謝產物內毒素是引起肝癌的根本原因，可做為進一步揭開肝癌的發病機理等研究方法的新途徑之一。

參考文獻4

[1]郭云霞,王郁杰,朱瑩.幽門螺桿菌感染與胃癌的相關性探討[J].中華醫院感染學雜志.2014,24(7): 1 700-1 701.

[2]吳兵,張崇移,李銘芬. 人乳頭狀瘤病毒感染與宮頸病變的相關性研究[J].中華醫院感染學雜志.2013,23(10): 2 377-2 379.

[3]解玲玲,朱元民,劉玉蘭.特異性細菌感染與結直腸癌發病的關系[J].中華消化雜志. 2014,34(5): 359-360.

[4]Yoshiji H,Yoshii J,Ikenaka Y,et al.inhibition of reninangiontensin system attenuates liver enzyme-alreed preneoplastic lesions and fibrosis development in rats[J].J Hepatol,2002,37(1):22-30.

[5]Shin Yoshimoto,Tze mun Loo,Hiroaki Kanda,et al. Obesity-induced gut microbial metabolite promotes liver cancer through senescence secretome[J].Natrure,2013, 499：97-102.

[6]Dianne H.Dapito,Ali Mencin,Geum-Youn Gwak.er al.Promotion of hepatocellular carcinoma by th intestinal microbiota and TLR4[J]. Cancer Cell. 2012, 21(4):504-516.

[7]李強，張雅萍.抗內毒索IgY 體外拮抗內素效應的實驗研究[J]．第三軍醫大學學報，2004，26(7)：610.

[8]Knasmuller S,Steinkellner H,Hirschl AM,et al.Impact of bacteria in dairy products and of the intestinal microflora on the genotoxic and carcinogenic effects of heterocyclic aromatic amines[J].Mutat Res,2001,480:129-138.

(收稿2015-06-21)

·論著·

3)重慶醫科大學第二附屬醫院泌尿外科重慶400000

【摘要】目的探討內毒素在二乙基亞硝銨(DEN)誘發小鼠肝癌過程中的作用。方法 四組雄性小鼠均喂食致癌物DEN液，A組為無菌小鼠，B組無菌小鼠腹腔注射內毒素，C組為普通小鼠，D組普通小鼠腹腔注射抗內毒素IgY。觀察肝癌發生率和血清內毒素水平。結果內毒素水平最高的B組和C組肝癌發生率最高，內毒素水平最低的A組和D組肝癌發生率也最低，內毒素水平和肝癌發生率呈顯著正相關。結論細菌的代謝產物內毒素是引起肝癌的根本原因。

【關鍵詞】內毒素; 細菌;二乙基亞硝銨; 肝癌

Role of endotoxin in pathogenesis of hepatocellular carcinoma in miceHanDianbing,ZengBenhua,GeChengguo.DepartmentofHepatobiliarySurgery,thePeople’sHospitalofRuzhouCity,RuhouHenan467500,China

【Abstract】ObjectiveTo explore the role of endotoxin in HCC induced by the DEN.MethodsFour groups of male mice were fed with DEN. Group A is the germ free mice, group B is also the germ free mice injected by endotoxin in abdominal cavity. group C is normal bacterial mice, group D is also normal bacterial mice injected by anti-endotoxin IgY in abdominal cavity.ResultsThe highest level of endotoxin in B group and C group had the highest incidence of hepatocellular carcinoma, the lowest level of endotoxin in A group and D group, the incidence of HCC is lowest. Endotoxin levels and the incidence of HCC was positively related.ConclusionEndotoxin is the root cause of liver cancer.

【Key words】Endotoxin;Bacteria;DEN;HCC

【中圖分類號】R-332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1077-8991(2015)06-0001-03