結核分枝桿菌耐藥表型與耐藥基因型相關性研究進展

陳 珊(CHEN Shan)，劉厚明(LIU Hou-ming)，單萬水(SHAN Wan-shui)

(1 廣東醫科大學，廣東 湛江 524000； 2 深圳市第三人民醫院，廣東 深圳 518000)

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·綜述·

結核分枝桿菌耐藥表型與耐藥基因型相關性研究進展

陳 珊(CHEN Shan)1，劉厚明(LIU Hou-ming)2，單萬水(SHAN Wan-shui)2

(1 廣東醫科大學，廣東 湛江 524000； 2 深圳市第三人民醫院，廣東 深圳 518000)

結核分枝桿菌； 分子機制； 表型耐藥； 耐藥基因

20世紀80年代以來，結核病(tuberculosis，TB)疫情呈全球性回升趨勢，我國作為全球最大的發展中國家，同時也是全球TB疫情最嚴重的國家之一[1]。隨著全球耐藥結核病(drug-resistant tuberculosis，DR-TB)的出現和傳播，特別是耐多藥結核病(multidrug-resistant TB，MDR-TB)、廣泛耐藥結核病(extensively drug-resistant TB，XDR-TB),以及全耐藥結核病(totally drug-resistant TB，TDR-TB)發生率的增高，全球TB的有效治療和控制受到嚴重威脅。深入研究結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)的耐藥分子機制，發現基因突變是MTB產生耐藥的重要原因。現就各抗結核藥物的耐藥表型與耐藥基因型的相關性研究進行綜述。

1 MTB耐利福平(rifampin，RFP)

RFP為半合成廣譜殺菌劑，是最有效的抗結核藥物之一，在短期化學治療中起重要作用。RFP通過與細菌RNA聚合酶的β亞單位牢固結合，抑制細菌mRNA的合成，防止該酶與DNA連接，從而干擾、阻斷RNA轉錄過程。MTB RNA聚合酶β亞單位由rpoB基因編碼，當rpoB基因個別密碼子發生突變時，DNA依賴性RNA聚合酶β亞單位的空間構象發生改變，無法與RFP結合，從而表現為耐藥。

現已知95%～99%的MTB耐RFP主要是因rpoB基因在507-533位密碼子共81 bp的核心區域內(rifampicin resistance determining region，RRDR)[2-3]堿基發生突變、缺失、顛換等導致。最常見的突變位點為531位點TCG(Ser)-TTG(Leu)，526位點CAC(His)-TAC(Tyr)、GAC(Asp)、CTC(Leu)，516位點GAC(Asp)-GTC(Val)[4]。已發現的突變位點還有450、511、512、513、514、515、517、518、522、524、530、533位點等。近年來，RFP耐藥基因rpoB的突變特征成為各國研究熱點，不同國家報道的rpoB基因突變位點及每個位點的突變率并不完全相同。孟加拉的研究[5]表明，207株耐RFP菌株中，最常見的突變位點為531(57.4%)，其次526(22.9%)、516(7.3%)，個別菌株在513、530、533位點突變，另有5%耐藥菌株未發現基因突變。在531位點有相似突變率的國家不在少數，如尼泊爾為57.8%[6]，摩洛哥為59.6%[7]，新加坡為54.9%[8]，泰國為58.5%[9]，巴西為56.1%[10]等；較高突變率的國家有西班牙(72.3%)[11]、緬甸(63.6%)[12]。由此可見，rpoB基因有明顯的地域性突變差異。針對耐RFP臨床分離株的研究中發現(MIC法測定結果)，RRDR區域內不同堿基突變耐RFP水平不同，531、526和516位點突變常導致高水平耐藥(MIC>32 μg/mL)，511、513、514、533位點突變一般引起低水平耐藥。此外，研究[13]表明，約90%的耐RFP菌株往往也耐其他一線抗結核藥物。耐RFP是判斷MDR-TB菌株的風向標，而rpoB基因突變為RFP耐藥的主要原因，由此可見，快速、準確檢測rpoB基因突變不僅有助于指導臨床精準用藥，提高療效，而且可有效防控MDR-TB的傳播。

2 MTB耐異煙肼(isoniazid，INH)

INH是一種前體藥，性質穩定，通過被動擴散方式進入增長期的MTB中，由菌體內過氧化氫-過氧化物酶(katG酶)激活，產生活化的游離自由基，如活性氧化物、活性有機物等，能抑制細胞壁分枝菌酸的合成，破壞細胞壁的完整性，引起細菌增殖力、抗酸性等生理功能喪失，達到殺菌目的。研究[14]發現，使用INH一段時間后，INH本身會誘導MTB基因突變，產生基因型耐INH菌株。INH耐藥機制復雜，涉及菌體中的KatG酶、烯酰脂酰載體蛋白還原酶(inhA)、β-酮酰基運載蛋白合成酶(kasA)、烷基過氧化氫酶還原酶(ahpC)和還原型輔酶Ⅰ脫氫酶(ndh)等多基因突變。

2.1KatG基因KatG基因編碼KatG酶，在菌體內將INH氧化成異煙酸，參與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶I(NAD)的合成，抑制細胞壁分枝菌酸的合成。當KatG基因發生完全缺失或突變時，導致細胞中過氧化氫酶不被表達或活性降低，從而引起結核分枝桿菌對INH耐藥。絕大部分耐INH菌株中均有KatG基因表達，僅24%的耐INH結核菌株中KatG基因完全缺失，且均是MIC>50 μg/mL的高度耐藥株。KatG基因突變可能是MTB耐INH更重要、更普遍的原因。30%～95%的耐INH菌株存在KatG突變。有記載的KatG突變位點約300種，最常見的是密碼子S315(AGC)突變成蘇氨酸(ACC)、天冬氨酸(AAC)、精氨酸(CGC)、異亮氨酸(ATC)、甘氨酸(GGC)等，94%以上是S315T突變。另有104、108、 138、 141、148、 270、 275、314、328、341、378、381、394、420、 463、494、553、595、658等位點突變，大部分可導致INH耐藥。據報道[15]，不同堿基突變的菌株其過氧化氫酶活性及INH耐受程度不同。如S315T、W341G、G494D和R595S等與高濃度INH耐藥有關，而S315N、L141F、 E553K和 F658V等與低濃度INH耐藥有關。但是，并非所有密碼子突變均與INH耐藥有關，如R463L位點突變較常見，且在INH敏感株中的突變率高于耐藥株，但其突變并不影響KatG酶活性，提示該突變位點的存在為基因多態性[16]。簡言之，KatG基因S315T是結核菌株耐INH的主要分子機制，但也有因基因多態性而存在的突變位點和無KatG基因突變卻耐INH的菌株，提示MTB中存在其他耐INH的途徑。

2.2inhA基因inhA基因編碼烯酰基乙酰載體蛋白還原酶，分子量約為32 kd的蛋白質，參與分枝菌酸的生物合成，是INH的作用靶點。inhA突變多見于調節序列的啟動子區，包括點突變和堿基缺失，突變頻率較高的位點包括C-15T、T-8C，目前發現的突變位點還有16、72、90、94、98、105等。Tekwu等[17]研究發現，低水平耐INH菌株中，inhA(C-15T)突變率達50%(10/20)，因此認為inhA編碼基因的突變常見于低耐藥菌(MIC=0.2 μg/mL)。各地區耐INH菌株中inhA基因突變率并不相同，陳楊等[18]研究結果為30%，韋紅玉等[19]研究結果為20%。inhA除單一位點突變外，少部分聯合KatG出現雙基因突變，占耐藥菌株的8.5%，當inhA與KatG基因聯合突變時，INH的耐藥性明顯增強。

2.3oxyR-ahpC基因區oxyR基因編碼的蛋白既是基因轉錄的活化劑，又是感受氧壓的感受器。oxyR基因本身無生物活性，是一假性基因，與MTB對INH的敏感性無關，但因oxyR蛋白參與KatG和ahpC基因的表達，因而與MTB的耐藥性有關。ahpC基因啟動子位于oxyR-ahpC基因區，耐INH菌株常在此區域發生突變。據研究[20]報道，在MTB耐INH臨床分離株中，oxyR-ahpC突變率可達39.6%(19/48)，其中G-46A突變位點占31.2%。當oxyR-ahpC突變，能代償性增加ahpC表達，填補KatG酶的缺乏，為MTB抗氧化應激反應提供保護。有學者視ahpC突變為KatG損傷的一種標志，然而兩者并無直接因果關系，大部分耐INH菌株發生KatG突變時并不伴有ahpC突變。

2.4kasA基因kasA基因編碼β-酮酰基運載蛋白合成酶，屬Ⅱ型脂肪酸合酶系統，參與分枝菌酸的合成。kasA基因突變不常見，占異煙肼INH耐藥菌株的10%，已發現的突變位點有66、121、269、312 和387等，其中G312S最常見，但在部分INH敏感株中亦存在312位點突變，因此考慮該突變位點可能為基因多態性。除312位點外，KasA基因中還存在部分INH耐菌株和敏感株中均有的突變位點，所以KasA基因在MTB產生INH耐藥過程中的作用仍需進一步研究。

2.5 其他基因 除KatG、inhA、oxyR-ahpC、KasA等基因外，近年還發現許多可能與MTB耐INH有關的基因，如ndh、iniA、iniB、iniC、accD6、efpA、furA、nal、msbA等。如ndh基因編碼NADH脫氫酶，突變可引起酶活性缺失，NADH含量增加，NAD+減少，NADH/NAD+比例改變，使INH過氧化被抑制造成耐藥，常見突變位點V18A。上述大多基因與INH耐藥的關系并未十分明確，還有待進一步研究證實。

3 MTB耐鏈霉素(streptomycin，SM)

SM是氨基環醇糖苷類抗生素，通過誘導遺傳密碼錯讀，抑制翻譯啟動及干擾校正過程，影響蛋白質的合成而發揮抗菌作用。研究[21]表明，編碼小亞基核糖體蛋白S12的rpsL和編碼16SrRNA的rrs基因突變是MTB耐SM的主要分子機制。約80%耐SM菌株存在rpsL或rrs突變，其中rpsL突變率高于rrs。rpsL最常見突變位點是第43和88位密碼子，第43位密碼子不僅突變率最高，且與高濃度SM耐藥有關。該位點有限制性內切酶MboⅡ的識別序列(GAAGGA)，易使Lys突變為Arg，部分菌株Lys-Thr。在耐SM菌株中，rrs突變主要集中于530莖-環區和915核苷區，已發現426(G-C)、491(C-T)、512(C-T)、513(A-C)、513(A-T)、514(A-C)、516(C-T)、903(C-G)、903(C-A)、904(A-C)、905(A-G)等突變位點。部分菌株有雙突變位點，如rrs513(A-C)合并rpsL43(A-G)，rrs905(A-G)合并rpsL88(A-G)，但類似聯合突變不常見。近年有學者認為，7-甲基鳥苷-甲基轉移酶的編碼基因gidB與低水平SM耐藥有關，gidB基因突變使保守的M7G甲基化轉移酶修飾丟失，從而產生低水平SM耐藥[22-23]。但在RFP、INH耐藥而SM敏感的菌株中亦有gidB突變，因此需加強gidB與SM表型耐藥相關性的研究。除上述耐藥基因外，約1/3的臨床SM耐藥株無rpsL或rrs突變，提示可能有其他SM耐藥機制存在。

4 MTB耐乙胺丁醇(ethambutol，EMB)

EMB是一種合成的阿拉伯糖類藥物，發揮抗菌效力最關鍵的作用靶點是阿拉伯糖基轉移酶。EMB能抑制其聚合阿拉伯半乳聚糖，從而影響分枝菌酸-阿拉伯半乳聚糖-肽聚糖復合物(細胞壁的重要成分)的形成，同時使RFP等藥物更易進入細胞內，因而EMB與RFP具有協同抗結核的作用。編碼阿拉伯糖基轉移酶的embABC操縱子突變或emb蛋白過度表達與EMB耐藥密切相關，過度表達引起EMB低耐藥，基因突變導致EMB高耐藥。embABC操縱子由embC、embA、embB 3個基因組成，其中embB基因突變是MTB耐EMB的主要原因。embB基因約3 246 bp，編碼1個糖基轉移酶，其突變可導致糖基轉移酶結構改變，影響EMB與糖基轉移酶的相互作用產生耐藥。embB基因最常見第306位突變，占embB基因突變的90%，包括M306V、M306I、M306L。此外，第285、306、313、319、328、330、406、497及630位等密碼子突變可引起EMB耐藥。但是，學術界對embB306突變與EMB耐藥關系存在爭議。普遍認為embB306突變可作為快速診斷MDR的標準[24]，但也有研究發現，embB306突變不僅存在于EMB耐藥株中，部分敏感株中亦有。

5 MTB耐吡嗪酰胺(pyrazinamide,PZA)

PZA為煙酰胺類似物，最大特點是需要在酸性環境中才表現出抗菌活性，殺死半休眠期MTB，且MIC與pH呈正相關性。PZA在細胞外酸性環境下滲透進入MTB內，菌體內的吡嗪酰胺酶(PZase)將其轉化為對MTB有毒性作用的吡嗪酸(POA)而發揮殺菌作用。PZase高活性是PZA發揮抗MTB作用的關鍵，而PZase編碼基因pncA突變造成的PZase活性缺失或降低被認為是MTB耐PZA的主要原因。pncA基因約561 bp，其突變類型包括點突變、上游調控序列變異、核苷酸插入或缺失、小片段插入等。目前，已發現的pncA突變位點約175種，呈彌散分布無規律可循，最常見突變位點為A-11G，還有第47位(Thr-Ala)，第85位(Leu-Pro)。研究[25]發現，部分PZA耐藥株中并未出現pncA基因突變，且少數EMB耐藥株發生了pncA突變但未對PZase活性產生明顯影響，表明pncA突變并非唯一的PZA耐藥機制。

6 結語

綜上所述，MTB菌體內與抗結核藥物作用靶點有關的編碼基因突變是結核菌耐藥的主要作用機制，但大部分藥物仍存在其他耐藥機制，有待進一步研究發現，耐藥表型與基因型之間的相關性仍需進一步深入研究。因此，加強對抗結核藥物作用機制及MDR耐藥機制的研究，尋找與耐藥基因突變有關的誘導因素，并建立新的高效、靈敏、特異、價廉的結核菌耐藥性檢測方法十分必要。總之，人類在抗TB的道路上任重而道遠，但筆者堅信，隨著分子生物學及遺傳學的發展，新型檢測技術的成熟，在不久的將來包括TB及MDR-TB在內的很多傳染病都會從根本上得到遏制。

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(本文編輯：左雙燕)

Advances in correlation between drug resistance phenotype and genotype ofMycobacteriumtuberculosis

(1 Guangdong Medical University, Zhanjiang 524000, China; 2 The Third People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518000, China)

2016-05-24

深圳市科技計劃項目(JCYJ20140411113637598)；深圳市科技研發資金項目(JCYJ20130401164749996)；深圳市“三名工程”專項資金

陳珊(1990-)，女(漢族)，湖南省益陽市人，碩士研究生，主要從事結核分枝桿菌耐藥性分子機制及檢測方法的研究。

單萬水 E-mail：13923478156@qq.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.11.021

R378.91+1

A

1671-9638(2016)11-0883-04