熒光分光光度法測(cè)定高良姜飲片中高良姜素的含量

楊　嵐，支　嶺，宋成軍，苗光新，吳曉光，劉翠哲

(承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德　067000)

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熒光分光光度法測(cè)定高良姜飲片中高良姜素的含量

楊嵐，支嶺，宋成軍，苗光新，吳曉光，劉翠哲*

(承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德067000)

[摘要]目的：建立高良姜素含量測(cè)定的熒光分光光度法。方法：選擇了熒光最佳的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，給出最佳分析參數(shù)。結(jié)果：在λex/λem=450 nm/528 nm條件下，熒光強(qiáng)度與高良姜素的含量在0.01～0.10 μg/mL呈良好的線性關(guān)系，測(cè)得高良姜飲片中高良姜素的含量為0.82%。結(jié)論：熒光分光光度法方法簡(jiǎn)便、快速、檢測(cè)限低,準(zhǔn)確度高，可用于藥材高良姜飲片中高良姜素的含量測(cè)試。

[關(guān)鍵詞]熒光分光光度法；高良姜飲片；高良姜素

高良姜是姜科山姜屬植物高良姜Alpinia officinarum Hance的干燥根莖。其味辛，性溫。具有溫胃祛寒、理氣祛風(fēng)、消食止痛的功效。主治腹脘疼痛、胃寒吐瀉、噯氣吞酸、消積食滯、消化不良等癥，是中醫(yī)臨床上常用的溫里藥。高良姜素(Galangin，3，5，7-三羥基黃酮)是高良姜最主要的藥理活性成分，對(duì)高良姜的鑒別具有獨(dú)特的專屬性。臨床藥理學(xué)研究表明高良姜素具有抗氧化、抗細(xì)菌、抗病毒等多種生理活性，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值和研究前景[1-3]。

熒光分光光度法具有靈敏度高、專屬性強(qiáng)、方法簡(jiǎn)便快速、檢測(cè)限低、取樣量少，工作曲線線形范圍寬，儀器設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于藥物、生物樣品及環(huán)境樣品的分析及測(cè)定[4,5]。目前，測(cè)定高良姜飲片中高良姜素的含量方法主要為高效液相色譜法，但是高效液相色譜法具有儀器昂貴，檢測(cè)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)[6,7]。本實(shí)驗(yàn)利用高良姜素的熒光特性, 首次采用直接測(cè)定法，建立了高良姜飲片提取物中高良姜素的含量測(cè)定方法。

1材料

1.1試劑

高良姜飲片(同仁堂大藥房)；高良姜素(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：130501，純度：99%)；乙醇、硼酸、磷酸、冰醋酸等試劑均為分析純；雙蒸水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2儀器

F-4500熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)；KQ-250DE型超聲波清洗器(40 kHz) (昆山市超聲儀器有限公司)；BS-210S電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；pHS-3C型精密酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)。

2方法

2.1高良姜素對(duì)照品溶液的配制

精密稱取高良姜素1 mg置于燒杯中加無(wú)水乙醇溶解，將其轉(zhuǎn)移至10 mL的容量瓶中，加無(wú)水乙醇定容至刻度。取1.0 mL該對(duì)照品溶液置于100 mL容量瓶中定容至刻度，得濃度為1.0 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2三酸緩沖溶液的配制

精密稱取硼酸2.47 g置于燒杯中加雙蒸水溶解，再用移液管分別移取磷酸和冰醋酸各2.30 mL，將其全部轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，用雙蒸水定容至刻度，配制成三酸混合液。稱取氫氧化鈉2.0 g置于燒杯中加雙蒸水溶解，將其轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，用雙蒸水定容至刻度。分別量取三酸混合溶液100 mL和不同體積的氫氧化鈉與廣口試劑瓶中混勻，用精密酸度計(jì)微調(diào)至所需的pH，分別得到6種不同pH值的三酸緩沖液。

2.3高良姜飲片提取物樣品溶液的制備

取10 g粉碎的高良姜粉末置于錐形瓶中，加入濃度75%的乙醇溶液200 mL，在溫度55 ℃，提取功率100 W，超聲提取30 min，共提取3次，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮，無(wú)水乙醇溶解至10 mL備用。

3結(jié)果

3.1高良姜素的熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

精密量取高良姜素對(duì)照品溶液200 μL，加三酸緩沖液定容至2.0 mL，在300～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)高良姜素對(duì)照品溶液進(jìn)行激發(fā)波長(zhǎng)的掃描，高良姜素激發(fā)波長(zhǎng)為450 nm，固定該激發(fā)波長(zhǎng)，在450～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行發(fā)射波長(zhǎng)的掃描，得到其發(fā)射波長(zhǎng)為528 nm。選擇該最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)(即λex/λem=450 nm/528 nm)作為后繼測(cè)定的工作條件。

3.2高良姜素對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取高良姜素對(duì)照品溶液0、25.0、50.0、100.0、150.0、200.0 μL，加三酸緩沖液分別定容至2.0 mL，在λex/λem=450 nm/528 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度，結(jié)果表明溶液的熒光強(qiáng)度(F)與溶液濃度(c)在0.01～0.10 μg/mL呈良好的線性關(guān)系。如圖3-1、3-2所示。回歸方程為：F=2 744.40 c+53.72，r=0.996 5。

圖3-1高良姜素的熒光波譜(1～5濃度由低到高)

Fig 3-1The Fluorescence Spectroscopy of Galangin

(Concentration from Low to High 1～5)

圖3-2　高良姜素溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3緩沖溶液pH對(duì)高良姜素?zé)晒鈴?qiáng)度的影響

本實(shí)驗(yàn)考察了不同pH的三酸緩沖溶液對(duì)高良姜素?zé)晒鈴?qiáng)度的影響,如圖2-3所示。

圖3-3　緩沖溶液pH對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響結(jié)果

1.pH=9.02. pH=8.03. pH=10.04. pH=7.05. pH=11.06. pH=6.07. pH=4.0

從圖3-3可以看出當(dāng)pH在8.0～10.0時(shí)，高良姜素?zé)晒鈴?qiáng)度最大且比較穩(wěn)定，因此，本實(shí)驗(yàn)選定的緩沖溶液的pH為9.0。

3.4熒光分光光度法測(cè)定高良姜素含量的準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取高良姜素對(duì)照品溶液和樣品溶液100.0 μL，加三酸緩沖液定容至2.0 mL，在λex/λem=450 nm/528 nm下測(cè)熒光強(qiáng)度。如圖3-4所示，對(duì)照品溶液和樣品溶液在相同位置出現(xiàn)最大吸收，該方法準(zhǔn)確性良好。

圖3-4　高良姜素含量的準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)

3.5熒光分光光度法測(cè)定高良姜素含量的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)考察了0、10、20、30、60、90、120、180 min8個(gè)反應(yīng)時(shí)間對(duì)高良姜素?zé)晒鈴?qiáng)度的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。可以看出，隨放置時(shí)間的延長(zhǎng)，高良姜素的熒光強(qiáng)逐漸減小，計(jì)算RSD為2.2%，熒光強(qiáng)度在0～3 h內(nèi)基本穩(wěn)定，因此應(yīng)保證在3 h內(nèi)測(cè)定熒光。

表1　高良姜素含量的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

3.6熒光分光光度法測(cè)定高良姜素含量的精密度實(shí)驗(yàn)

精密量取高良姜素樣品溶液100.0 μL，加三酸緩沖溶液定容到2.0 mL，在λex/λem=450 nm/528 nm下測(cè)熒光強(qiáng)度。結(jié)果見(jiàn)表2，計(jì)算RSD為3.03%，由此可知，該方法的精密度良好。

3.7熒光分光光度法測(cè)定高良姜素含量的加樣回收率實(shí)驗(yàn)

稱取6份高良姜提取物樣品溶液，進(jìn)行加樣回收實(shí)驗(yàn)，在λex/λem=450 nm/528 nm下測(cè)熒光強(qiáng)度。計(jì)算高良姜素平均回收率為98.99%，RSD為3.78%，表明該方法用于測(cè)定高良姜飲片中高良姜素的含量效果良好。

3.8熒光分光光度法測(cè)定高良姜提取物樣品含量

稱取高良姜粉末10.0 g，平行測(cè)定6組。按2.3項(xiàng)下樣品溶液的制備方法制備樣品溶液，在λex/λem=450 nm/528 nm下測(cè)熒光強(qiáng)度。計(jì)算高良姜素的平均含量為0.82%，RSD為5.50%。

4討論

實(shí)驗(yàn)在確定高良姜素的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的基礎(chǔ)上，進(jìn)而研究體系中緩沖溶液、反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)高良姜素?zé)晒鈴?qiáng)度的影響，從而確定了最優(yōu)條件，建立了高良姜飲片中高良姜素的熒光含量測(cè)定方法。

在緩沖溶液為pH為9.0時(shí)，高良姜素的熒光強(qiáng)度最大，從而選定緩沖溶液pH為9.0。通過(guò)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、精密度實(shí)驗(yàn)、準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)了實(shí)驗(yàn)方法的可行性。測(cè)得高良姜飲片中高良姜素的含量為0.82%。

實(shí)驗(yàn)建立了熒光分光光度法測(cè)定高良姜飲片中高良姜素的含量，該方法取樣量小、操作簡(jiǎn)便、快速靈敏。

[參考文獻(xiàn)]

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本文編輯：王知平

·臨床醫(yī)學(xué)·

Determination of Galangin in Alpinia Officinarum Hance Pieces by Fluorescence Spectrophotometry

YANG Lan, ZHI Ling, SONG Chengjun, MIAO Guangxin, WU Xiaoguang, LIU Cuizhe

(ChengdeMedicalCollege,Chengde067000,Hebei,China)

[ABSTRACT]Objective: To establish the fluorescence spectrophotometry method for the determination of galangin in alpinia officinarum hance pieces by fluorescence spectrophotometry. Methods: The optimum fluorescence excitation wavelength and emission wavelength was investigated. The optimum analytical parameters were obtained. Results:The linear range of galangin was 0.01～0.10 μg/mL under given condition of λex/λem=450 nm/528 nm. It was found that extraction using molecular imprinted polymers for selective extraction of flavonoid from alpinia officinarum was satisfactory. The content was 0.82%. Conclusions: The fluorescence spectrophotometry method is simple, rapid and highly accurative with a low detection limit, which shows good promising applications.

[KEYWORDS]fluorescence spectrophotometry; alpinia officinarum hance pieces; galangin

[中圖分類(lèi)號(hào)]R917

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-0126(2015)01-0001-03

[通訊作者]劉翠哲，女，教授，從事中藥制劑現(xiàn)代化研究， E-mail：liucuizhexy@163.com

[作者簡(jiǎn)介]楊嵐，女，助教，從事中藥研究與開(kāi)發(fā)工作

[基金項(xiàng)目]承德醫(yī)學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究基金(201413)