同步熒光法同時測定溶解態的菲與2-乙基菲

劉洋之,楊承虎,朱亞先,張　勇,3*

(1.近海海洋環境科學國家重點實驗室，廈門大學　環境與生態學院，福建　廈門　361102；2.廈門大學

化學化工學院　化學系，福建　廈門　361005；3.漳州職業技術學院，福建　漳州　363000)

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同步熒光法同時測定溶解態的菲與2-乙基菲

劉洋之1,楊承虎1,朱亞先2,張勇1,3*

(1.近海海洋環境科學國家重點實驗室，廈門大學環境與生態學院，福建廈門361102；2.廈門大學

化學化工學院化學系，福建廈門361005；3.漳州職業技術學院，福建漳州363000)

摘要：將同步熒光法結合人工神經網絡(ANN)和支持向量回歸(SVR)用于混合體系中熒光光譜重疊的菲(Phe)和2-乙基菲(2-EP)兩組分的同時測定。通過三維同步熒光法結合平行因子(PARAFAC)分析尋得Phe和2-EP的特征波長差Δλ為118 nm。在220～280 nm范圍內，以31個波長處熒光強度值作為模型的輸入變量用于建立ANN和SVR模型。結果顯示，ANN模型分析Phe和2-EP預測樣本的回收率分別為92.5%～104.9%和96.1%～104.3%，預測均方根誤差(RMSEP)分別為2.08和2.95；SVR模型分析預測樣本的回收率分別為98.2%～101.3%和94.9%～104.2%，RMSEP分別為0.74和2.42。實際水樣的加標回收實驗顯示，基體簡單的礦泉水中兩種模型均取得滿意結果；而基體復雜的湖水中樣品預測值較實際值低，且SVR模型比ANN的預測性能更加穩健，泛化能力更強。將同步熒光法結合SVR模型應用于Phe和2-EP單獨及混合狀態下與腐植酸(HA)相互作用的研究，結果顯示混合體系中Phe和2-EP與HA的結合系數均小于各自單組分體系，表明Phe和2-EP之間存在競爭吸附。

關鍵詞：同步熒光法；菲；2-乙基菲；人工神經網絡(ANN)；支持向量回歸(SVR)

目前有關多環芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)環境行為和毒理學的研究大多針對母環PAHs(Parent PAHs)開展[1]，但已有研究結果表明，忽略烷基PAHs(Alkyl PAHs)的存在對PAHs進行環境風險評價將會顯著低估其值[2]。實際環境中Parent PAHs與Alky PAHs共同存在且會進一步代謝轉化，為科學有效地評價水環境中PAHs的毒性效應，有必要建立同時測定Parent PAHs與Alky PAHs的分析方法。

多年來，Parent PAHs的分析方法不斷改進[3-5]，但僅有少數有關Alkyl PAHs的檢測報道[6]，所用氣相色譜-質譜(GC-MS)法成本高、耗時長、前處理過程復雜，且萃取法破壞了目標化合物在水環境中的原始賦存狀態。相對于常規熒光法，同步熒光法因具有選擇性好等優點而被用于環境樣品中多組分PAHs的分析檢測[7]。另一方面，化學計量學方法在多組分PAHs分析中的應用也日益受到重視。屈薇薇等[8]使用熒光法結合人工神經網絡(Artificial neural network,ANN)對蒽和芘進行同時測定，取得滿意結果。Larrechi等[9]利用平行因子(Parallel factor analysis,PARAFAC)分析法研究了4種Parent PAHs的光降解行為。

本文以菲(Phe)和2-乙基菲(2-EP)分別代表Parent PAHs和Alkyl PAHs，利用同步熒光法結合ANN和支持向量回歸(Support vector regression,SVR)，嘗試建立了同時測定Phe和2-EP的分析方法，并用于實際水樣的測定及其與腐植酸(Humic acid,HA)相互作用的研究。以期為Parent PAHs與Alkyl PAHs的環境行為及生物有效性評價提供方法基礎。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

Cary Eclipse熒光分光光度計(Varian,USA)，1.0 cm石英比色皿，Cary-50紫外可見分光光度計(Varian,USA)，KQ3200型超聲波清洗器(150 W,昆山市超聲儀器有限公司)。

Phe(純度> 98%,Aldrich,USA)，2-EP(純度>99%,Aldrich,USA)，HA(Technical grade Aldrich,USA)，乙醇(分析純，上海振興化工一廠)，實驗用水為Milli-Q水，實際水樣來自廈門大學翔安校區內湖水及商品礦泉水。

1.2實驗方法

表1　訓練樣本及預測樣本的濃度設置

準確稱0.10 g Phe和2-EP分別配制成1.0 g·L-1乙醇儲備液，采用逐級稀釋法分別配成400 μg·L-1的Phe和2-EP工作液，避光儲存于4 ℃冰箱中。配制14個不同濃度比的兩組分混合溶液作為訓練樣本(Sample No.:1～14)[6]，另取3個人工合成樣品為預測樣本(Sample No.:15～17)。具體濃度配比如表1所示。

三維熒光光譜掃描：激發波長200～350 nm，發射波長330～450 nm，步距均為2 nm；三維同步熒光光譜掃描：激發波長220～280 nm，步距均為2 nm；同步熒光光譜掃描：Δλ=118 nm，激發波長范圍為220～280 nm。激發狹縫為10 nm，發射狹縫為5 nm。實驗數據在Matlab中進行PARAFAC及ANN分析，在Libsvm軟件包中進行SVR分析。

2結果與討論

2.1同步熒光波長差Δλ的選擇

由圖1可知，單組分Phe和2-EP的三維熒光和三維同步熒光光譜嚴重重疊，因此傳統熒光法無法實現Phe和2-EP混合組分的同時檢測。同步熒光法具有簡化譜圖、提高選擇性等優點[10]，且與三維熒光法相比能縮短分析時間。利用PARAFAC解析三維同步熒光光譜，可獲取Phe和2-EP的一個特征差異Δλ。對17個樣本的三維同步熒光數據采用一組分PARAFAC分析，得到激發波長和Δλ載荷(如圖2)，從圖中可觀察到Δλ為118 nm時，Δλ載荷最高，說明118 nm可作為Phe和2-EP混合組分的特征Δλ。

圖2　激發波長和Δλ載荷Fig.2　Excitation wavelength and Δλ loading

表2　同步熒光光譜法的分析特性(Δλ=118 nm)

2.2工作曲線、精密度與檢出限

分別配制一系列不同濃度的單組分Phe和2-EP溶液，Δλ為118 nm，以激發波長248 nm處的熒光強度值(I)對其濃度(x,μg/L)作圖，結果見表2。

分別配制9份50 μg·L-1的Phe和2-EP單組分溶液，測定其熒光值，計算得到Phe和2-EP的相對標準偏差(n=9)分別為1.0%和0.94%。同時測定10份Milli-Q水的熒光值，以其3倍標準的偏差除以工作曲線的斜率，計算得到Phe和2-EP檢出限分別為0.21 μg·L-1和0.30 μg·L-1。

2.3 ANN建模分析

本實驗使用包含一個隱含層的三層反向傳播網絡。以220～280 nm范圍內所測波長點對應的熒光強度值作為輸入變量，將對應樣品濃度作為輸出變量。因此，輸入層和輸出層的節點數分別為31和2。隱含層節點數需不斷調整以適應不同問題和數據集的復雜性[11]。參考Kolmogorov定理，根據經驗公式初步確定隱含層節點數范圍[12]。設置最大訓練次數為5 000，誤差目標值為10-4,以均方誤差(Mean square error,MSE)性能分析函數評估ANN性能。不斷改變網絡參數，當隱含層節點數為7，隱含層和輸出層傳遞函數分別為tansig和purelin函數，訓練函數為trainlm函數時，模型誤差最小，預測性能最佳。為保證網絡穩定并提高收斂速度，模型運行前對數據進行歸一化處理，隨后再反歸一化獲取實際值。

表3中Phe和2-EP的預測值均為10次隨機訓練結果的平均值。Phe和2-EP訓練樣本的預測回收率分別為94.6%～104.7%和91.4%～105.9%，校正均方根誤差(Root mean square error of calibration,RMSEC)分別為1.23和1.40，相關系數(r2)分別為0.998 0和0.999 1。Phe和2-EP預測樣本的預測回收率分別為92.5%～104.9%和96.1%～104.3%，預測均方根誤差(Root mean square error of prediction,RMSEP)分別為2.08和2.95，相關系數(r2)分別為0.997 4和0.982 2。

表3　訓練樣本及預測樣本的回收率結果

2.4SVR建模分析

采用Libsvm(Library for support vector machine)[13]進行回歸分析，其特點是簡單、易使用，并能快速有效地進行支持向量機(Support vector machine,SVM)模式識別和回歸，所采用的算法是序列最小優化算法[14]。本文采用Vapnik提出的ε-SVR模型[15]。SVR有不同的核函數類型，如徑向基核函數RBF、多項式核函數、二層神經網絡核函數及線性核函數，其中RBF核函數能減少訓練過程的復雜性，使用最為廣泛[16]。通過對不同核函數建模分析，顯示RBF核函數的效果最好，所以本文選取RBF核函數進行ε-SVR分析。

首先將數據縮放到[0,1]之間，并對數據進行歸一化處理。懲罰因子C、核寬度參數γ及ε是建立ε-SVR模型的3個最重要參數。該參數在很大程度上決定了算法的學習和泛化能力，所以需尋找合適的參數值以提高SVR預測精度。本文采用網格搜索法結合留一交叉驗證法尋找最佳參數值，采用交叉驗證過程可有效避免過擬合問題[13]。對于Phe，尋得C，γ及ε的最優參數值分別為1 024，0.031 3和0.5，2-EP的對應值分別為1 024，0.125和1。

選用RBF核函數為最優參數值，采用兩個SVR模型分別對Phe和2-EP建模分析。如表3所示，Phe和2-EP訓練樣本的預測回收率分別為95.0%～105.5%和79.4%～123.1%，RMSEC分別為1.42和1.72，相關系數(r2)分別為0.997 2和0.998 5。Phe和2-EP預測樣本的預測回收率分別為98.2%～101.3%和94.9%～104.2%，RMSEP分別為0.74和2.42，相關系數(r2)分別為0.999 5和0.988 1。

2.5實際水樣中Phe與2-EP的測定

為驗證兩種模型方法的準確性，取礦泉水和湖水(過0.22 μm濾膜)兩種不同基體的實際水樣，分別向水樣中加入Phe 和2-EP。采用上述條件對基體樣品和加標樣品進行同步熒光掃描，并采用ANN和SVR進行建模分析。湖水含有一定量的溶解性有機質(Dissolved organic matter,DOM)，部分DOM有吸收和熒光，建模前需扣除基體熒光信號，并進行內濾校正[17]。表4為實際水樣的預測結果，礦泉水對熒光信號測定無干擾，所以兩種模型的預測值與真實值一致。湖水樣中預測值比加標值低(除ANN模型下2-EP樣品外)，可能與DOM對Phe和2-EP的結合有關，且基體復雜樣品中SVR模型比ANN模型的預測性能更加穩健。由表3結果同樣可以看出，盡管ANN模型的RMSEC比SVR模型小，但RMSEP較SVR模型大，表明SVR模型的泛化能力比ANN強。因為，ANN以傳統統計學為基礎，需有大量數據進行網絡訓練，而SVR以統計學習理論為基礎，能較好解決小樣本、非線性和局部極小點等問題。由表4可知，熒光法結合化學計量法的回收率結果與固相萃取(SPE)聯合氣相色譜(GC)法的結果基本一致，但熒光法較SPE-GC法的操作簡單，無需額外有機溶劑，且不改變PAHs原始賦存狀態，可實現快速原位檢測。

表4　實際水樣的回收率結果

2.6Phe及2-EP與腐植酸(HA)結合能力的測定

熒光猝滅法因快速、靈敏及非破壞性等優點被廣泛用于PAHs與HA結合能力的研究[18]。通常將有機碳歸一化結合常數(KOC)作為衡量PAHs與HA結合能力強弱的重要指標。利用文獻所述KOC計算方法[19]，分別將50 μg·L-1Phe和2-EP加至HA溶液(2 mg·L-1DOC)中，利用同步熒光法結合SVR模型研究Phe和2-EP單獨及共存狀態下與HA的結合能力。如表5所示，同步熒光法結合SVR模型與傳統熒光猝滅法所得lgKOC無顯著差異，且2-EP與HA的結合能力比Phe大，這與2-EP的辛醇水分配系數lgKOW大于Phe的lgKOW有關。混合體系中Phe和2-EP的結合能力均小于單組體系，表明Phe和2-EP之間存在競爭吸附。

表5　Phe和2-EP單組分及兩組分與腐殖酸的結合常數

*no data

3結論

利用同步熒光法結合ANN和SVR模型可實現混合溶液中光譜嚴重重疊的Phe和2-EP兩組分的同時測定。對于基體復雜水樣，SVR模型比ANN模型的預測性能更加穩健。相比于SPE-GC法，所建方法操作簡便，為原位快速同時測定水溶液中Phe和2-EP的濃度提供了一種新思路。利用同步熒光法結合SVR模型可測定Phe和2-EP單獨及共存時與HA的結合常數。該方法有望用于原位研究微生物對溶解態Parent PAHs及Alkyl PAHs兩組分共存時降解過程及其生物毒性(如青鳉魚)評價，為進一步認識PAHs的生態風險提供了一種新方法。

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Simultaneous Determination of Dissolved Phenanthrene and 2-Ethylphenanthrene in Aqueous Solution by Synchronous FluorescenceLIU Yang-zhi1,YANG Cheng-hu1,ZHU Ya-xian2,ZHANG Yong1，3*

(1.State Key Laboratory of Marine Environmental Science of China(Xiamen University),College of Environment and Ecology,

Xiamen361102,China；2.Department of Chemistry,College of Chemistry and Chemical Engineering,Xiamen

University,Xiamen361005,China；3.Zhangzhou Institute of Technology,Zhangzhou363000,China)

Abstract：A method was developed for the simultaneous determination of phenanthrene(Phe)and 2-ethylphenanthrene(2-EP) in water by synchronous fluorescence spectroscopy combined with artificial neural network(ANN) and support vector regression(SVR).The characteristic wavelength offset(Δλ)is 118 nm by adopting three dimensional synchronous fluorescence spectroscopy with parallel factor analysis(PARAFAC).In range of 220-280 nm,the fluorescence intensities at 31 wavelengths were regarded as input variables for ANN and SVR models analysis.The results showed that the recoveries of Phe and 2-EP prediction samples were in the ranges of 92.5%-104.9%and 96.1%-104.3%,respectively,obtained by ANN model,while the recoveries of Phe and 2-EP were 98.2%-101.3%and 94.9%-104.2%,respectively by utilizing SVR model.The prediction root mean square errors(RMSEP)of Phe and 2-EP were 2.08 and 2.95 with ANN model,meanwhile they were 0.74 and 2.42 with SVR model,respectively.Recovery experiments by standard addition in actual water samples demonstrated that a satisfactory result was obtained with the two models for mineral water(simple matrix).However,predictive values were lower than the actual values for lake water(complex matrix),in which the performance of SVR model was more steady,and had stronger generalization ability than ANN model.Moreover,the synchronous fluorescence spectroscopy coupled with SVR was used to simultaneously calculate the binding coefficients of Phe and 2-EP with humic acid(HA)in a mixture solution.The result showed that the bonding capabilities of Phe and 2-EP in the mixed systems are both less than those in single component system,which indicated that there is a competing absorption existing between Phe and 2-EP.

Key words：synchronous fluorescence spectroscopy;phenanthrene(Phe);2-ethylphenanthrene(2-EP);artificial neural network(ANN);support vector regression(SVR)

中圖分類號：O657.3；O625.15

文獻標識碼：A

文章編號：1004-4957(2015)12-1366-06

doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2015.12.006

通訊作者：*張勇，博士，教授，研究方向：環境化學，Tel：18959288685，E-mail：yzhang@xmu.edu.cn

基金項目：國家自然科學基金(21177102，21075102)；國家海洋局海洋溢油鑒別與損害評估技術重點實驗室開放基金(201405)

收稿日期：2015-05-10；修回日期：2015-05-25