新生鼠壞死性小腸結腸炎動物模型建立方法改進

劉斌　閻靜江　李曉霞

[摘要] 目的 使用環境模擬實驗裝置建立一個更為標準及簡便易行的新生兒壞死性小腸結腸炎動物模型造模方法。方法 75只新生24 h昆明小鼠隨機分為5組，A1、A2和A3組采用人工喂養+缺氧復氧冷刺激+LPS灌胃；B組單純人工喂養，C組為正常對照組。飼喂72 h后處死小鼠，進行腸道組織病理學評分。 結果 處理組新生鼠腸道組織與單純人工喂養組及正常對照組相比差異均有統計學意義（P<0.05），且實驗結果重復性較好。 結論 使用環境模擬實驗裝置建立的NEC動物模型在病因學上符合NEC 的病理生理特點，并將動物模型造模裝置規范化，改善了自制裝置重復性較差的缺點，更適用于研究新生兒壞死性小腸結腸炎。

[關鍵詞] 新生兒壞死性小腸結腸炎；腸道損傷；動物模型；新方法

[中圖分類號] R725.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）35-0022-04

[Abstract] Objective To establish a standard and simple method of the neonatal necrotizing enterocolitis（NEC） animal model by the environment simulation equipment. Methods Seventy-five newborn mice at age of 24 hours were randomLy divided into 5 groups. Group A1 group， A2 group and A3 group were given artificial feeding， discontinuities cold/hypoxia exposure and LPS gavage. Group B was only given artificial feeding. Group C was a control group. Mice were sacrificed after being fed for 84 hours. Intestinal histopathology was scored. Results There was statistically significant between group A1， group B and group C （P<0.05）. In addition， all the repeated tests were obtained a same result. Conclusion The NEC animal model established by environmental simulation experiment was coincidence of the character of pathophysiology for NEC and improved the poor repeatability disadvantage， which made the NEC model device more normalizes. Thus， the model was very suitable to research NEC.

[Key words] Neonatal necrotizing enterocolitis； Injury of intestine； Animal model； New method

壞死性小腸結腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是一種具有潛在致死性的新生兒胃腸道急癥，由于缺乏有效預防治療措施，患兒死亡率較高，對新生兒存活率有著嚴重影響，從而受到臨床醫生和研究人員的高度重視。近年來，由于小兒重癥監護病房（PICU）的應用及醫務人員綜合素質的提高，許多早產兒和低體重兒得以存活，NEC的發病率也隨之有增加趨勢[1-4]。因此，在NEC的研究中迫切需要建立一種簡便易行、既高效又規范的新生兒NEC 動物模型建模方法，以進一步探求該疾病的發病機制并進行有效的預防治療。由于目前國內外模型建立方法主要為自制實驗器材，器材尚無統一標準[5-9]，故本研究目的是以國內外研究為基礎，對建模器材及方法加以改進，建立一個標準且簡單易行的新生兒NEC 動物模型造模方法，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組

本次實驗動物均購自山西醫科大學，符合國標GB14922-94無特定病原體動物級質量標準。取用新生昆明小鼠75只，雌雄不限，體重約5～10 g。新生鼠出生24 h后即與母鼠分離，隨機分成5組，處理組A1、A2和A3參考多因素聯合造模方案[10]，持續處理72 h，并分別由不同實驗員對處理組A1、A2和A3組分別進行操作；處理組B采用單純人工喂養，持續處理72 h；對照組C采用母鼠乳喂養作為正常對照。

其中，處理組A1、A2、A3和處理組B出生后即置入環境模擬實驗裝置中通過鼠乳代用品進行人工喂養；對照組C測量體重并標記后返回各自母鼠旁，繼續與母鼠同籠，鼠乳喂養。

實驗過程中新生鼠如發生死亡或嚴重實驗意外（如外傷、逃逸等）則進行排除，不計入實驗結果。

1.2 主要試劑及儀器

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），雀巢特別能恩早產/低出生體重配方奶粉，英脫利匹特脂肪乳注射液（C14-24），小兒復方氨基酸注射液（19AA-Ⅰ），BD 密閉式靜脈留置針24G，環境模擬實驗裝置（專利號201110214221.5）。

1.3 造模方法

1.3.1 人工喂養 新生鼠置于環境模擬實驗裝置內進行人工喂養，配制人工代乳品（表1）[11]，采用留置針去芯軟針頭進行管飼。喂養前用脫脂棉球蘸生理鹽水對新生鼠口腔及面部皮膚進行清潔。人工喂養所使用的留置針每次使用完畢后即刻在流動水中清洗。清潔后使用75%醫用酒精消毒，并密封保存。再次使用前應用滅菌生理鹽水進行沖洗以去除表面附著的酒精。試驗中使用的留置針每鼠一支，不重復使用。首日每次喂養量控制在不少于0.1 mL，以后每過24 h喂養量增加0.1 mL，每日喂養次數不少于8次，視新生鼠具體情況調整飼喂間隔，夜間新生鼠活動性下降，飼喂間隔可酌情延長。

1.3.2 缺氧復氧冷刺激 于實驗狀態的環境模擬實驗裝置內充入純氮，箱內氧氣濃度降至零后迅速將新生鼠由保育狀態的環境模擬實驗裝置中轉移至實驗狀態的環境模擬實驗裝置內，持續以1.5 L/min通入氮氣，維持窒息 1 min后將提前4℃預冷處理的水袋放入環境模擬實驗裝置內，并將裝置溫度調至4℃，將新生鼠放置在水袋上進行低溫處理，同時，持續以1.5 L/min流量通入氧氣，控制氧濃度大于50%，刺激10 min。處理后將新生鼠移回保育狀態的環境模擬實驗裝置，每日刺激3次。

1.3.3 LPS灌胃 LPS以10 g/kg稀釋于0.1 mL滅菌水中，使用去芯留置針頭通過口腔插管灌胃，每日1次，連續3 d。

1.4 標本采集

各組乳鼠每日定時稱量體重，于造模開始后第72小時停止飼喂處死取標本。在小鼠腹部正中切開腹腔，分離腸血管及系膜。取回盲部及其遠近端共5 cm腸管置入包埋盒進行石蠟包埋，所有標本采集均在冰上完成。

1.5 腸組織病理學檢查與評分

回盲部及其遠近端共5 cm腸管石蠟包埋后，作4～5 μm 連續切片，常規HE 染色，采用隨機數法對每個切片進行隨機編號，觀片人員采用盲法對每個標本進行腸道組織的病理學評分，病理學評分采用雙盲法，評分標準參考Nadler標準[12]。評分細則如下：0分：腸道組織結構正常，腸道上皮、絨毛完整；1分：黏膜下或固有層輕有微腫脹分離；2分：黏膜下和（或）固有層中度分離，黏膜下和（或）肌層水腫；3分：黏膜下和（或）固有層重度分離，黏膜下和（或）肌層水腫，局部絨毛脫落；4分：腸絨毛消失并伴有腸壞死等。評分≥2分者視為模型動物發生了NEC病理改變。

1.6 統計學分析

數據分析用SPSS11.5（SPSS公司，美國）軟件在Windows XP環境下進行。計量數據資料使用中位數和四分位數間距M（Q）表示，多組間數據比較采用Kruskal-Wallis H 秩和檢驗法進行分析，進一步根據平均秩次進行兩兩比較，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

處理組A1、A2、A3組新生鼠在實驗開始后24 h內即出現主動活動減少，對外界刺激反應減緩甚至消失。同時伴有排黃綠色甚至黑色稀便等大便性狀的改變。開始實驗后處理組A1、A2、A3組和處理組B組新生鼠均出現不同程度出現腹脹和胃潴留的癥狀。對照組C組生長發育無明顯異常，體重增長穩定，主動活動及對外界刺激反應良好，進食及排便正常，無消化道異常表現。

2.2 外觀改變

處理組A1、A2、A3組和處理組B組腸道組織均與對照組相比有明顯差異。處理組A1、A2和A3組腸道外觀改變較為明顯，回盲部近端大段腸管外觀呈黑紅色，光澤度及彈性明顯下降。處理組B 組可見回盲部近端腸管顏色呈黃紅色，部分腸管可見污黃色，光澤和彈性較正常組織有下降。此外，處理組A1、A2、A3組和處理組B組新生鼠腸腔內均有不同程度積氣，少數重度者可呈串珠樣，尚無腸穿孔癥狀出現。對照組C組腸管顏色粉嫩，有光澤，彈性良好，未見積氣。

2.3 病理學改變

在處理組A1、A2、A3組新生鼠腸道組織病理可見明顯壞死。鏡下可見腸壁絨毛變性水腫，壞死、甚至脫落消失。腸壁內腺體排列紊亂，甚至消失，腸道肌層不同程度變薄甚至部分斷裂。重度固有層及黏膜下層水腫，伴有大量炎性細胞浸潤，病理學評分均為 3～4 分（封三圖1），與正常對照組新生鼠相比有統計學意義（P<0.05）。處理組B組新生鼠鏡下可見中度絨毛充血水腫，腺體排列紊亂，個別可見輕度的壞死，部分伴有中性粒細胞浸潤，與處理組A1、A2、A3組新生鼠炎癥程度差異有統計學意義（P<0.05），且與正常對照組C組新生鼠差異有統計學意義（P<0.05）。正常對照組C組新生鼠的腸道結構完整，未見明顯病理學改變。見表2。

3 討論

小腸及結腸的廣泛斑片狀壞死是NEC的主要特征，一旦發生即可在短期內引發全身性敗血癥和多器官功能衰竭，進而導致死亡。迄今為止，NEC確切的病因及發病機制尚未被完全闡明，現階段的研究僅提示：不當人工喂養、早產及感染等是NEC發病的危險因素。近年來國內外大量研究也顯示：循環LPS濃度在NEC患者和NEC的動物模型中均呈升高趨勢[13]；而且循環LPS濃度的增加可進一步破壞腸道上皮細胞[14]，并激活白細胞，釋放大量炎性細胞因子[15]。綜合以上觀點認為NEC的主要病理生理過程為：多種因素相互作用下導致的黏膜損傷誘發患兒產生繼發性免疫應答，進一步導致腸道黏膜內抗炎—促炎因子平衡的失衡，從而引起一系列腸道壞死性改變。

目前大部分NEC動物模型造模采用的都是自制實驗裝備，因為裝備制作工藝和功能的限制，導致了NEC動物模型在造模過程中無法規范實驗條件，其他實驗室在進行重復實驗時無法還原參考文獻中的造模條件，導致NEC動物模型造模實驗條件實際上各不相同。特別是實驗中無規范的新生動物保育措施，容易導致模型動物本身處于非保育狀態，對實驗結果產生干擾，甚至出現意外死亡。本研究采用了環境模擬實驗裝置（專利號201110214221.5）替代大多數文獻中使用的自制新生鼠保育裝置，該裝置優勢在于可以通過顯示器實時監控保育箱溫度、濕度、氧濃度及氣壓等多項指標，并可通過程序自動調節氣體排量，維持穩定氣壓，可以避免實驗氣體大量快速進入而造成的實驗動物損傷，通過負壓排氣裝置配合內部空氣循環裝置可以在短時間將氣體完全置換，且氣密性較好，不易發生漏氣或換氣不全等情況，特別適合于新生動物保育及缺氧窒息等特殊通氣條件下的動物實驗。本研究中還將多因素聯合造模實驗分為3次進行，由不同實驗人員在不同時間段進行，正式實驗前需通過幾次預實驗使實驗人員對人工喂養技術和環境模擬實驗裝置操作進行熟悉，減少因為操作生疏造成的實驗動物意外傷害，最終重復實驗結果之間并無明顯統計學差異（表2），證明使用環境實驗模擬裝置制作的NEC動物模型可重復性較強，有利于實驗模型的推廣和改進。

在本研究前期預實驗中發現，國內外文獻普遍提及的缺氧窒息時間為10 min甚至更長[10]，但實際使用環境模擬實驗裝置進行缺氧窒息2 min后動物死亡率就達100%，多次重復實驗均呈類似結果，因無法還原其他實驗室自制保育裝置難以具體分析其實際原因，因此根據預實驗結果將本研究中缺氧窒息時間調整為1 min，在保證盡可能減少實驗動物意外死亡的前提下給予適當的缺氧窒息。

在臨床實踐中，NEC 最常見的發病原因是早產兒喂養不當和缺氧，感染等導致的，其中喂養不當往往是最主要的致病原因，部分患兒出生后僅有喂養不當史而無缺氧窒息和感染史，因此本實驗將人工喂養作為單一條件進行造模，并與多因素聯合造模進行比較，病理結果顯示，人工喂養作為單一因素造模也會造成腸道損傷，但與多因素聯合造模結果相比腸道損傷程度差異有統計學意義（P<0.05），多因素聯合造模更接近NEC發病的臨床特征，更為科學合理。本研究中單純人工喂養的新生鼠病理評分為1（1）分[M（Q）]，腸道損傷程度較輕，且未發生意外死亡及其他疾病表現，新生鼠活動性及外觀狀況接近于鼠乳喂養新生鼠，說明環境模擬實驗裝置保育性能較好，在非實驗狀態可以給予動物較為穩定的保育環境。

本研究中使用環境模擬實驗裝置建立的NEC動物模型采用多因素聯合造模方式，綜合了臨床常見的危險因素包括：早產、產后窒息、腸道致病菌感染、不當人工喂養、缺血再灌注損傷等，符合NEC 的病理生理特點。本研究中使用的環境模擬實驗裝置將NEC動物模型造模裝置規范化，改善了自制裝置重復性較差的缺點，加強了非實驗狀態下的保育措施，更適用于新生兒壞死性小腸結腸炎的研究。

[參考文獻]

[1] Jane SL，Richard AP. Treatment and prevention of necrotizing enterocolitis[J]. Seminars in Neonatology，2003，8（6）：449-459.

[2] Sharma R，Hudak ML. A clinical perspective of necrotizing enterocolitis[J]. Clinics in Perinatology，2013，40（1）：27-51.

[3] 曾振華. 新生兒壞死性小腸結腸炎研究現狀及發展趨勢探究[J]. 中外醫學研究，2014，26（27）：152-153.

[4] 張婉嫻. 128例新生兒壞死性小腸結腸炎臨床分析[D].長春：吉林大學，2013.

[5] 高曉燕，高平明，肖昕. 壞死性小腸結腸炎誘導全身炎癥反應綜合征動物模型血漿細胞因子表達變化[J]. 中國新生兒科雜志，2014，29（2）：123-126.

[6] 王亨，于惠，余光濤，等. 益生菌對新生大鼠壞死性小腸結腸炎作用的試驗[J]. 中國獸醫雜志，2015，51（4）：27-30，50.

[7] 雷一慧，沈海青，何雪梅，等. 乳凝集素對新生大鼠壞死性小腸結腸炎腸道損傷修復和TLR4表達的影響[J]. 上海交通大學學報（醫學版），2015，35（7）：967-972，977.

[8] 楊曉，梁琨. 促紅細胞生成素對壞死性小腸結腸炎新生大鼠腸道Bcl-2及caspase-3蛋白表達的影響[J]. 臨床兒科雜志，2015，33（2）：179-183.

[9] 鄧慶先，賀湘英，黃永坤，等. 谷氨酰胺對新生鼠壞死性小腸結腸炎增殖細胞核抗原的影響[J]. 臨床兒科雜志，2015，33（3）：276-279.

[10] 李金純，韋紅，賈盛華，等. 新生兒壞死性小腸結腸炎動物模型建立方法改進與比較[J]. 重慶醫科大學學報，2009，34（3）：313-317.

[11] Le Mandat Schultz A，Bonnard A，Barreau F，et al. Expression of TLR-2，TLR-4，NOD2 and pNF-kappaB in a neonatal rat model ofnecrotizingenterocolitis[J]. P LoS One，2007，2（10）：e1102.

[12] Nadler EP，Dickinson E，Knisely A，et al. Expression of inducible nitric oxide synthase and interleukin-12 in experimental necrotizing enterocolitis[J]. Journal of Surgical Research，2000，92（1）：71-77.

[13] Meinzen-Derr J，Morrow AL，Hornung RW，et al. Epidemiology of necrotizing enterocolitis temporal clustering in two neonatology practices[J]. J Pediatr，2009，154（5）： 656-661.

[14] Caplan MS，Jilling T. New concepts in necrotizing enterocolitis[J]. Curr Opin Pediatr，2001，13（2）：111-115.

[15] Balázs N，Gy？觟rgy T，Judit JH，et al. The cost-effectiveness of ulipristal acetate tablets in treating patients with moderate to severe symptoms of uterine fibroids[J]. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology，2014，12（3）：229.

（收稿日期：2015-09-21）