大鼠肢體缺血/再灌注后心肌細胞凋亡及氧化應激的調節作用

朱　娜　要瑞莉　劉俊雙　馬俊利

(唐山職業技術學院基礎醫學部，河北　唐山　063000)

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大鼠肢體缺血/再灌注后心肌細胞凋亡及氧化應激的調節作用

朱娜要瑞莉劉俊雙1馬俊利

(唐山職業技術學院基礎醫學部，河北唐山063000)

摘要〔〕目的觀察大鼠肢體缺血/再灌注(I/R)后心肌細胞凋亡及Bcl-2/Bax表達的變化和氧化應激的調節作用。方法健康雄性Wistar大鼠30只，隨機分成對照組、肢體I/R 2 h組(I/R 2 h組)和4 h組(I/R 4 h組)。免疫組化法檢測心肌組織Bcl-2/Bax蛋白表達；原位末端脫氧核糖核苷酸轉移酶標記(TUNEL)技術檢測心肌凋亡細胞；生化法檢測血漿心肌酶含量；比色法測定心肌組織活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量的變化。結果肢體I/R后與對照組比較，血漿心肌酶含量升高；心肌組織ROS和MDA含量增加，SOD活性降低(P<0.05)；心肌凋亡細胞明顯增加(P<0.01)；心肌組織Bcl-2與Bax表達增強，但Bax表達較Bcl-2明顯上調，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.01)；相關分析顯示，ROS含量與Bax蛋白表達平均吸光度值和凋亡指數(AI)之間呈顯著正相關(P<0.01)。結論大鼠肢體I/R后可致心肌細胞凋亡；心肌細胞凋亡與Bcl-2/Bax蛋白表達比值降低和心肌氧化應激增強有關。

關鍵詞〔〕缺血/再灌注；心??；凋亡；Bcl-2；Bax；氧化應激

1中國人民解放軍第255醫院心內科

第一作者：朱娜(1977-)，女，碩士，講師，主治醫師，主要從事肢體缺血再灌注損傷的防治及機制研究。

研究表明，嚴重的肢體缺血/再灌注(I/R)后可致心肌組織損傷〔1〕。臨床和實驗證實，凋亡存在于各種心臟損傷的相關疾病過程中〔2，3〕，并對其發生發展產生重要影響。氧化應激是誘導心肌細胞凋亡的一個主要機制〔4〕，但目前對于氧化應激通過何種機制介導心肌細胞凋亡仍不十分清楚。本實驗旨在研究大鼠肢體I/R后心肌細胞凋亡及Bcl-2/Bax的調節作用和氧化應激的影響。

1材料與方法

1.1主要藥品活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購于南京建成生物工程研究所，TUNEL試劑盒、Bcl-2、Bax多克隆抗體、即用型免疫組化試劑盒購于北京中山生物技術公司。

1.2動物分組及模型制備健康雄性Wistar大鼠(280±20)g隨機分為三組，每組10只，術前喂養14 d。對照組：常規飼養，雙后肢松弛環繞橡皮圈，不阻斷血流，其余操作同肢體I/R組。肢體I/R分為I/R 2 h和I/R 4 h組，按照文獻〔5〕建立大鼠肢體I/R模型。用橡皮圈環繞結扎大鼠雙后肢根部，阻斷4 h后松解，恢復血流灌注2 h和4 h后分別自大鼠腹主動脈取血處死動物，即刻開胸取出心臟，于心尖部橫斷切取長約0.5 cm的心肌組織放入中性甲醛固定，其余組織放入液氮-70℃保存。

1.3測定指標

1.3.1血漿心肌酶含量的測定從腹主動脈放血處死動物并收集血液，取抗凝血離心后分離血漿，用HI-TACHI7200全自動生化分析儀測定肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量。

1.3.2心肌組織ROS、MDA和SOD含量的測定取心肌組織200 mg，放入裝有2 ml冷生理鹽水制成勻漿，于低溫下經3 500 r/min離心15 min，收集上清液，根據化學比色法分別測定ROS、MDA和SOD的含量。

1.3.3心肌細胞凋亡的原位檢測檢測方法嚴格按說明書操作。陰性實驗對照：經固定和消化的樣品中加入不含末端脫氧核糖核酸轉移酶的標記溶液代替TUNEL反應混合液。細胞核呈棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡細胞，計算6個高倍視野(×400)下的凋亡細胞數，凋亡指數(AI)以凋亡細胞/100個細胞表示。

1.3.4心肌組織Bcl-2和Bax蛋白表達測定取心尖部心室肌組織，多聚甲醛固定石蠟包埋切片，按免疫組化常規操作。以0.01 mol/L PBS代替一抗為陰性對照。細胞質呈棕黃色染色者為陽性細胞。采用Motic醫學圖像分析系統軟件對各組大鼠心肌組織切片進行分析，鏡下以相同外部條件攝取圖像(×200)，每張隨機選擇6個視野，得出陽性目標平均光密度值，每張切片取平均值。

1.4統計學分析采用SPSS13.0統計軟件，行方差分析、q檢驗，相關分析采用Pearson相關分析法。

2結果

2.1各組血漿CK、CK-MB含量的變化肢體I/R 2 h組與對照組比較，血漿CK和CK-MB含量分別升高了61.1%和128.6%(P<0.01)；肢體I/R 4 h組與對照組比較，血漿CK和CK-MB含量進一步升高，分別升高144.4%和246.4%(P<0.01)，見表1。

組別CK(μmol/L)CK-MB(μmol/L)對照組0.36±0.090.28±0.11I/R2h組0.58±0.081)0.64±0.101)I/R4h組0.88±0.101)0.97±0.101)

與對照組比較：1)P<0.01

2.2各組動物心肌組織ROS、MDA、SOD含量變化肢體I/R 2 h組與對照組比較，心肌組織ROS和MDA含量分別升高了24.2%和25.7%(P<0.05)，SOD含量降低了12.4%(P<0.05)；肢體I/R 4 h組與對照組比較，心肌組織ROS和MDA含量分別升高了77.9%和48.3%(P<0.01)，SOD含量降低了21.6%(P<0.01)，見表2。

組別ROS(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)SOD(U/mgprot)對照組34.26±1.329.49±2.9171.55±6.21I/R2h組42.54±1.481)11.92±1.481)63.66±3.721)I/R4h組60.94±2.102)14.07±2.482)56.82±4.832)

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

2.3各組心肌凋亡細胞的變化TUNEL染色可見陽性細胞核呈棕黃色，形狀不規整；肢體I/R 2 h組與對照組比較，心肌組織可見凋亡細胞增多，AI升高，但無差異顯著性。肢體I/R 4 h組與對照組比較，心肌組織可見凋亡細胞顯著增多，AI升高(P<0.01)，見表3，圖1。

2.4心肌組織Bcl-2和Bax蛋白表達的檢測Bcl-2和Bax主要存在于心肌細胞、血管內皮細胞，陽性細胞胞質或胞膜呈棕黃色顆?；騽蛸|狀。對照組呈弱陽性表達，肢體I/R 2 h組與對照組比較，Bcl-2表達未見明顯變化，Bax表達上調，肢體I/R 4 h組與對照組比較，Bcl-2和Bax表達均明顯上調，Bcl-2/Bax比值降低(P<0.01)，見圖2、圖3、表3。

2.5相關分析結果肢體I/R組心肌組織中ROS含量與Bax蛋白表達平均吸光度值和AI之間呈顯著正相關(r=0.746，P<0.01；r=0.643，P<0.01)。

組別AI(%)Bcl-2BaxBcl-2/Bax對照組2.53±1.070.120±0.0070.112±0.0091.080±0.116I/R2h組4.45±1.670.126±0.0090.132±0.0121)0.955±0.0671)I/R4h組16.59±2.592)0.160±0.0082)0.172±0.0102)0.935±0.0512)

圖1　TUNEL法檢測各組大鼠心肌細胞的凋亡形態學改變(×400)

圖2　免疫組化法檢測各組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白表達(DAB，×200)

圖3　免疫組化法檢測各組大鼠心肌組織Bax蛋白表達(DAB，×200)

3討論

嚴重的肢體I/R不僅局部經歷缺血再灌注損傷，甚至可導致遠隔器官心肌的損傷〔1〕。本實驗結果顯示，隨再灌時間延長，大鼠血漿心肌酶CK、CK-MB漏出增多。CK和CK-MB是催化心肌細胞代謝的重要酶類物質，是檢測心肌損傷的特異性指標。隨著再灌注時間延長，心肌酶泄露增多，預示心肌發生了損傷。為證實再灌注心肌發生了何種損傷，本實驗結果提示細胞凋亡存在于LI/R后心肌損傷過程中。

研究證實ROS是誘導多種心血管疾病發生的重要機制，介導整個損傷過程〔6〕。ROS對細胞的主要損傷是造成脂質過氧化，其代謝產物為MDA，間接反映組織細胞受ROS損傷的嚴重程度。SOD是體內主要的氧自由基清除酶，其活性強弱反映自由基清除水平。ROS的過量生成和(或)細胞內抗氧化防御系統受損，導致ROS及其相關代謝產物過量聚集而引起的氧化應激狀態，是肢體I/R后致遠隔器官損傷的主要機制。本實驗結果顯示，大鼠肢體在恢復血流供給后，心肌組織ROS大量產生，自由基清除酶SOD含量降低，脂質過氧化物MDA水平明顯增高，證實心肌處于氧化應激狀態。Cook等〔7〕首先研究發現H2O2或O2·等外源性ROS可誘導培養的乳鼠心肌細胞凋亡。研究表明，眾多上游應激信號，包括氧化應激、炎癥反應等與心肌細胞凋亡信號有明顯的交聯〔8〕。本實驗發現，ROS增加與心肌組織細胞凋亡的增加相一致，說明ROS是參與細胞凋亡的重要因素之一。細胞凋亡是細胞主動死亡的一種形式，主要受細胞內凋亡調控蛋白的影響，促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白間失衡所致。Bcl-2家族蛋白在調節細胞凋亡過程中起重要作用，Bcl-2是抑制細胞凋亡的基因，而Bax為Bcl-2的同源體，抑制Bcl-2作用，促進細胞凋亡〔9，10〕。Bcl-2與Bax可以結合成雜二聚體，兩者比率決定細胞凋亡的敏感性，當Bcl-2/Bax增加，抑制細胞凋亡，Bcl-2/Bax降低，促進細胞凋亡〔11〕。本研究表明Bcl-2和Bax表達的變化可能參與肢體I/R后心肌損傷，胞內Bcl-2/Bax比值是影響心肌凋亡的重要因素之一。直線相關分析提示ROS增加可能通過Bcl-2/Bax信號途徑參與了心肌凋亡，氧化應激源性激活的Bcl-2/Bax信號途徑在心肌損傷致心肌細胞凋亡中發揮重要作用。

參考文獻4

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〔2014-09-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

基金項目：唐山市科學技術研究與發展項目(No.12130239b)

中圖分類號〔〕R363.2〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)23-6666-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.010