硫化氫對糖尿病大鼠心肌纖維化及CX40和CX45表達的影響

肖　婷　羅　健　吳志雄　周松柏　李　芳　楊　軍

(南華大學附屬第一醫院心血管內科，湖南　衡陽　421001)

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硫化氫對糖尿病大鼠心肌纖維化及CX40和CX45表達的影響

肖婷羅健吳志雄周松柏李芳楊軍

(南華大學附屬第一醫院心血管內科，湖南衡陽421001)

摘要〔〕目的探討氣體信號分子硫化氫(H2S)對鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠心肌纖維化及縫隙連接蛋白C×40和C×45的影響。方法SD大鼠隨機分為對照組、糖尿病大鼠組(STZ組)、硫化氫干預糖尿病大鼠組(STZ+H2S組)及硫化氫干預正常大鼠組(H2S組)。腹腔注射STZ(40 mg/kg)建立糖尿病模型；糖尿病模型建立后，STZ組與H2S組每天腹腔注射濃度為100 μmol/kg硫氫化鈉溶液(H2S供體)；8 w后處死大鼠。堿水解法檢測羥脯氨酸表達水平；Western印跡檢測CX40和CX45蛋白的表達。結果與對照組相比，STZ組大鼠心肌組織羥脯氨酸表達明顯增加(P<0.01)，CX40表達明顯下降(P<0.001)，而CX45表達明顯增多(P<0.01)。與STZ組相比，硫化氫干預后的STZ+H2S組大鼠心肌組織羥脯氨酸明顯下降(P<0.01)，CX40表達明顯升高(P<0.01)，CX45表達有下調趨勢，但結果未顯示出統計學意義。結論H2S可改善糖尿病大鼠心肌纖維化，同時上調CX40蛋白的表達，可能參與糖尿病大鼠的心肌纖維化和縫隙連接重構的調控。

關鍵詞〔〕硫化氫；糖尿病；纖維化； CX40；CX45

第一作者：肖婷(1988-)，女，碩士，主要從事糖尿病心肌病發病機制研究。

糖尿病心臟病變包括心肌結構重構以及其伴隨的電生理重構，一方面心肌結構重構最終可導致心力衰竭；另一方面，糖尿病引起的電生理重構可明顯增加惡性心律失常和急性心臟事件的發生率〔1〕。而改善糖尿病心肌結構重構及電生理重構對于防治糖尿病心肌病和降低糖尿病患者急性心臟事件的發生率至關重要。縫隙連接是心肌細胞之間的半通道以及直接通訊，其生理作用主要是為心肌細胞間提供電化學交流，它與細胞的代謝和分化，物質的運輸和電興奮的傳導等有密切關系。縫隙連接重構可導致心肌細胞間電傳導異常，從而誘發心律失常。有研究發現硫化氫(H2S)可以改善糖尿病大鼠心臟重構〔2〕；此外，H2S還可以減少缺血再灌注心律失常的發生〔3〕，而H2S對糖尿病心肌縫隙連接重構的影響目前尚少見報道。本研究擬觀察糖尿病大鼠心肌纖維化及心室肌縫隙連接蛋白CX40和CX45表達的變化，同時探討H2S對糖尿病大鼠心肌纖維化和CX40和CX45蛋白表達的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物成年的雄性SD大鼠，體重(300±20)g，購自長沙動物實驗中心；動物飼養在恒溫(23±1℃)、恒濕(60%)的環境中，白天黑夜各12 h；實驗動物可以自由獲得食物和水。

1.2主要實驗試劑鏈脲佐菌素(STZ)購自美國MP Biomedicals Company;硫氫化鈉購于美國Sigma公司；羥脯氨酸堿水解法檢測試劑盒，購于南京建成工程研究所；BCA蛋白定量試劑盒、購于中國博士德公司細胞裂解液，購于碧云天公司；抗兔二抗購于美國Proteintech公司。

1.3實驗分組及糖尿病模型建立飼養大鼠1 w；隨機分為，對照組、糖尿病大鼠組(STZ組)、硫化氫干預糖尿病大鼠組(STZ+H2S組)及硫化氫干預正常大鼠組(H2S組)，每組7只。STZ組與STZ+H2S組大鼠根據體重腹腔注射STZ(40 mg/kg)；注射后的24 h，為防止大鼠發生低血糖休克，給予5%葡萄糖水；注射后72 h，尾靜脈采血測血糖，血糖>16.7 mmol/L提示造模成功。造模成功后，對照組和STZ組每天腹腔注射等量生理鹽水；STZ+H2S組與H2S組每天腹腔注射硫氫化鈉溶液(100 μmol/kg)；實驗持續8 w。

1.4堿水解法檢測羥脯氨酸表達水平取新鮮大鼠左心室心肌組織，提取組織蛋白，根據檢測試劑盒說明書處理樣本，加入96孔板，孵育30 min后置于450 nm波長檢測吸光度(OD值)，根據OD值計算羥脯氨酸表達量。

1.5Western印跡檢測CX40及CX45蛋白的表達取新鮮大鼠左心室心肌組織；研磨、離心后提取蛋白；采用BCA比色法進行蛋白定量，各組用PBS稀釋至相同濃度；蛋白樣品在100℃煮沸5 min；配置10%SDS-PAGE 分離膠、5%濃縮膠；按每孔20 μl細胞蛋白樣品上樣，置于電泳緩沖液中電泳，分離目的蛋白，將目的條帶切下，半干轉法轉膜(10 V，30 min)，將蛋白質轉移至PVDF膜。用TBST配制的5%BSA封閉2 h，封閉后分別孵育CX40及CX45一抗(稀釋度為1∶500)，4℃過夜；用TBST洗膜3次；每次10 min；用HRP標記的二抗(稀釋度為1∶2 000)37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL顯色，曝光后掃描，用Image J圖像分析軟件進行光密度分析。GAPDH為內參。

1.6統計學分析采用SPSS18.0軟件行單因素方差分析。

2結果

2.1H2S對糖尿病大鼠心室肌羥脯氨酸表達的影響與對照組〔(0.327±0.023)μg/mg〕相比，STZ組大鼠左心室心肌組織中羥脯氨酸表達〔(0.521±0.070)μg/mg〕明顯增加(P<0.01)，而與STZ組相比，STZ+H2S組大鼠心肌組織中的羥脯氨酸水平〔(0.370±0.084)μg/mg〕明顯下降(P<0.01)，H2S組為〔(0.331±0.052)μg/mg〕。

2.2H2S對糖尿病大鼠心臟CX40蛋白表達的影響與對照組(1.000±0.000)相比，STZ組大鼠心肌組織中CX40的表達(0.646±0.050)明顯下降(P<0.001)，而與STZ組相比，STZ+H2S組大鼠心肌組織中CX40表達(0.846±0.088)明顯上調(P<0.01)。H2S組為1.022±0.029。見圖1。

2.3H2S對糖尿病大鼠心肌CX45蛋白表達的影響與對照組(1.000±0.000)相比，STZ組中的大鼠心肌中的CX45表達(1.219±0.015)明顯增加(P<0.01)，而與STZ組相比，STZ+H2S組大鼠心肌組織CX45表達(1.195±0.033)有下調趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)，H2S組為0.906±0.025，見圖2。

圖1　H2S對糖尿病大鼠心肌組織CX40表達的影響

圖2　H2S對糖尿病大鼠心肌組織CX45表達的影響

3討論

糖尿病心臟損害是糖尿病主要的并發癥之一，糖尿病心肌病的主要表現就是心肌的結構重構和電生理重構，最終可導致心力衰竭和心律失常〔4〕。心肌纖維化是糖尿病心肌重構的主要表現，而膠原蛋白是構成結締組織中膠原纖維的主要成分，其中羥脯氨酸的含量最多，故通常以羥脯氨酸可以作為心肌纖維化檢測指標之一。本研究提示糖尿病大鼠心肌發生纖維化；與此同時，糖尿病大鼠心臟CX40表達明顯下降。CX40是電導最快的縫隙連接蛋白，主要分布在心室浦肯野傳導系統〔5〕。已知的縫隙連接蛋白中有5種位于心臟中，包括CX31.9、CX37、CX40、CX43和CX45，在人類心肌主要有CX40、CX43和CX45，其中CX43是心室肌細胞中主要的縫隙連接蛋白，其對維持心臟電活動的正常進行有著重要作用〔6〕，而CX40和CX45在心室肌中相對較少，研究也相對較少，但目前認為，CX40和CX45在心臟電生理重構中也起著重要作用〔7〕。CX45是電導速度慢于CX40的縫隙連接蛋白，其在心室表達水平略低于心房，主要分布在傳導組織。本文結果與Yamada等〔8〕在心力衰竭病人左心室肌中觀察到的結果類似，在其他縫隙連接蛋白，如CX40和CX43表達下調得同時，CX45表達卻明顯增高，可能是由于CX40和CX43表達下降后，心肌在電生理重構過程中代償性的出現CX45上調。

H2S是一種具有廣泛生理功能的氣體信號分子。大量研究證明了H2S的抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，在心血管系統和神經系統中扮演著保護劑的角色〔3，9，10〕。本研究發現，氣體信號分子H2S可明顯逆轉糖尿病所致大鼠心臟CX40和CX43表達下降(CX43的相關結果將于另文發表)，同時有抑制糖尿病大鼠心肌中CX45表達上調的趨勢，H2S對正常大鼠心臟組織CX40和CX45的表達均無影響。本研究結果提示，H2S可通過上調CX40和CX43表達改善糖尿病大鼠心肌的電生理重構，并有抑制糖尿病大鼠心肌中CX45上調的趨勢。而H2S干預改善糖尿病大鼠心肌縫隙連接重構的機制可能與其改善心肌纖維化和心肌結構重構有關。本研究結果提示H2S可通過減輕糖尿病大鼠心肌纖維化從而改善糖尿病大鼠心肌結構重構和電生理重構。但H2S改善縫隙連接重構在糖尿病心肌病防治中臨床應用以及其保護作用的信號轉導調控機制仍有待進一步研究。

參考文獻4

1Gallego M，Alday A，Urrutia J，etal.Transient outward potassium channel regulation in healthy and diabetic hearts〔J〕.Can J Physiol Pharmacol，2009;87(2):77-83.

2El-Seweidy MM，Sadik NA，Shaker OG.Role of sulfurous mineral water and sodium hydrosulfide as potent inhibitors of fibrosis in the heart of diabetic rats〔J〕.Arch Biochem Biophys，2011;506(1):48-57.

3陳協輝，李鵬，黃小平，等.氣體信號分子硫化氫對大鼠心肌缺血再灌注心律失常的影響〔J〕.心血管康復醫學雜志，2010;19(5):478-81.

4Galderisi M.Diastolic dysfunction and diabetic cardiomyopathy: evaluation by Doppler echocardiography〔J〕.J Am Coll Cardiol，2006;48(8):1548-51.

5Lo CW.Role of gap junctions in cardiac conduction and development: insights from the connexin knockout mice〔J〕.Circ Res，2000;87(5):346-8.

6龐勇，劉新偉，何東偉，等.縫隙連接蛋白43在七氟醚后處理保護大鼠離體心肌缺血再灌注中的作用〔J〕.第三軍醫大學學報，2012;34(14):1422-5.

7Sohl G，Willecke K.Gap junctions and the connexin protein family〔J〕.Cardiovasc Res，2004；62(2):228-32.

8Yamada KA，Rogers JG，Sundset R，etal.Up-regulation of connexin45 in heart failure〔J〕.Cardiovasc Electrophysiol，2003;11(14):1205-11.

9Kida K，Yamada M，Tokuda K，etal.Inhaled hydrogen sulfide prevents neurodegeneration and movement disorder in a mouse model of Parkinson′s disease〔J〕.Antioxidantredox Signal，2011;15(2):343-52.

10Wang Y，Zhao X，Jin H，etal.Role of hydrogen sulfide in the development of atherosclerotic lesions in apolipoprotein E knockout mice〔J〕.Arteriosclethromb Vasc Biol，2009;29(1):173-9.

〔2015-02-11修回〕

(編輯李相軍)

The effect of hydrogen sulfide on myocardial fibrosis and expressions of CX40 and CX45 in diabetic rats

XIAO Ting, LUO Jian, WU Zhi-Xiong,etal.

Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of South China University，Hengyang 421001，Hunan，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the effect of hydrogen sulfide(H2S) on myocardial fibrosis, CX40 and CX45 expressions of diabetic rats induced by STZ.MethodsSD rats were randomly divided into control, STZ, diabetic mellitus treated with H2S(STZ+H2S), normal rats treated with H2S(H2S)groups. Diabetic model was induced by intraperitoneal injections of STZ with 40 mg/kg body weight. NaHS (H2S donor) was intraperitoneal injected to STZ and H2S group with 100 μmol/kg body weight every day. Rats were killed 8 weeks later. The hydroxyproline expression was tested by Alkail hydrolysis. The CX40 and CX45 expressions were analyzed by Western blot.ResultsThe expression of hydroxyproline was obviously increased in diabetic rats heart, H2S decreased hydroxyproline expression of diabetic rats heart (P<0.01). CX40 expression was obviously decreased in diabetic rats heart, H2S increased CX40 expression of diabetic rats (P<0.01). The expression of CX45 was increased obviously in diabetic rats (P<0.01), H2S decreased expression trend of CX45, however, the difference showed no statistical significance.ConclusionsH2S could improve myocardial fibrosis of diabetic rats and increase expression of CX40. H2S might be related to the regulation of myocardial fibrosis and remodeling of gap junction in diabetic rats.

【Key words】Hydrogen sulfide; Diabetic; Fibrosis; CX40; CX45

通訊作者：楊軍(1972-)，男，醫學博士，主任醫師，副教授，碩士生導師，主要從事糖尿病心肌病研究。

基金項目：國家自然科學資助項目(No.81202830)

中圖分類號〔〕R587〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6025-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.010