胃泌素釋放肽受體拮抗劑RC-3095對大鼠肺組織纖維化的干預作用

伍素霞　惠復興

(張家港錦豐人民醫院，江蘇　張家港　215600)

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胃泌素釋放肽受體拮抗劑RC-3095對大鼠肺組織纖維化的干預作用

伍素霞惠復興1

(張家港錦豐人民醫院，江蘇張家港215600)

摘要〔〕目的研究胃泌素釋放肽(GRP)受體(R)拮抗劑RC-3095對大鼠肺組織纖維化的干預作用。方法構建肺組織纖維化大鼠模型，將大鼠隨機分為正常對照組(NC組)、模型組(MO組)、RC-3095處理組(RC組，20 μg/d)，檢測肺濕重、肺干重、肺系數，HE染色觀察肺組織病理變化，酶聯免疫吸附法檢測肺組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量，Western印跡檢測GRP、GRPR和轉化生長因子(TGF)β1蛋白表達情況，免疫共沉淀檢測GRP和GRPR相互作用情況。結果成功構建肺組織纖維化大鼠模型，MO組肺組織結構被破壞，肺泡間隔增厚，存在大量炎性細胞浸潤；RC組肺組織結構較為完整，纖維化程度降低。同時MO組肺組織濕重、干重和肺系數均高于NC組，RC組肺組織濕重、干重和肺系數均高于NC組但是低于MO組(P<0.05)。MO組中Ⅰ型膠原含量高于NC組，Ⅲ型膠原含量低于NC組。RC組中Ⅰ型膠原含量低于MO組，Ⅲ型膠原含量高于MO組(P<0.05)。RC-3095處理可有效抑制GRPR和TGFβ1蛋白水平，同時抑制GRPR和GPR的結合。結論RC-3095可以通過調節GRP和GRPR的結合能力及TGFβ1的蛋白水平有效地抑制肺部纖維化。

關鍵詞〔〕胃泌素釋放肽受體拮抗劑；RC-3095；肺組織纖維化

1無錫市人民醫院呼吸內科

第一作者：伍素霞(1966-)，女，副主任醫師，主要從事呼吸內科疾病研究。

長期吸入含結晶型游離二氧化硅(SiO2)的粉塵可以導致嚴重的肺部彌漫性纖維化，即矽肺〔1〕。肺組織纖維化的發病機制往往是由于肺部組織中膠原代謝失調造成的〔2〕。目前對肺組織纖維化的治療仍需要研發有效的治療藥物。胃泌素釋放肽(GRP)是哺乳動物體內蛙皮素類似物之一，GRP通過與GRP受體(GRPR)結合調節細胞增殖、分化、炎癥反應、癌癥發生等多種生理病理過程〔3〕。RC-3095是GRPR拮抗劑之一，本文主要研究RC-3095對大鼠肺組織纖維化的干預作用及臨床應用價值。

1材料與方法

1.1動物分組與模型建立30只健康成年大鼠，由本院動物中心提供，本實驗通過本院倫理協會同意。平均體重(258±32.15)g，隨機分為正常對照組(NC組)、模型組(MO組)、RC-3095處理組(RC組)。大鼠經0.4%戊巴比妥麻醉后，采用非暴露式氣管內注入法，注入1 ml SiO2混懸液(40 mg/ml)，用手輕拍大鼠兩側胸壁，使粉塵分散至全肺。NC組注入同體積生理鹽水。建立矽肺模型后，RC每日腹腔注射20 μg/d RC-3095，NC組和MO組注射等體積生理鹽水。所有實驗動物均SPF級動物房中分籠飼養，飲水飼料籠具和所有操作用品均滅菌處理后使用。

1.2肺組織病理分析培養4 w后處死大鼠，收集肺部組織用于檢測肺濕、干重、肺系數及肺組織病理學分析。肺濕、干重的測定方法：剪下肺葉，用濾紙吸干，稱濕重后置 110℃干燥箱內烘干至恒重。肺系數按照以下公式計算：肺系數=肺濕重(mg) /體重(g)×100%。將部分左肺葉置于 4%多聚甲醛中固定，常規石蠟包埋、切片后行蘇木素-伊紅(HE)染色及免疫組化檢測。

1.3ELISA法檢測肺組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量取肺組織50 g，液氮中充分研磨后，利用上海生工生物有限公司Ⅰ型和Ⅲ型膠原ELISA試劑盒檢測，操作按照說明書進行。

1.4Western印跡檢測GRP、GRPR和TGFβ1蛋白表達情況取肺組織50 g，液氮中充分研磨后，利用美國天根公司蛋白裂解液裂解獲得蛋白樣品，利用Western免疫印跡檢測肺組織中細胞內GRP、GRPR、轉化生長因子(TGF)β1的蛋白表達水平。GRP、GRPR、TGFβ1抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.5免疫共沉淀檢測GRP和GRPR相互作用情況取肺組織50 g，液氮中充分研磨后，利用美國天根公司蛋白裂解液裂解獲得蛋白樣品，加入5 μl GRP抗體，4℃孵育12 h，加入蛋白A (天根公司)孵育6 h后，用蛋白裂解液洗3次，每次10 min，4℃ 5 000 r/min離心1 min，收集珠子，加入20 μl上樣緩沖液，100℃煮5 min，利用GRPR抗體(美國SANTA公司)進行Western印跡實驗。

1.6統計學方法采用SPSS17.0統計軟件進行t、χ2檢驗。

2結果

2.1肺組織病理學改變NC組肺組織結構完整，肺泡腔內無炎性細胞浸潤，肺泡間隔無充血、水腫及增厚等現象；MO組肺組織結構被破壞，肺泡間隔充血水腫存在增厚現象，肺泡腔及肺間質內存在大量炎性細胞浸潤；RC組肺組織結構較為完整，與MO組相比炎癥細胞浸潤程度較輕，肺泡間隔增厚現象不明顯。見圖1。MO組肺組織濕重〔(4.23±0.57)g〕、干重〔(1.73±0.46)g〕和肺系數(12.27±0.48)均明顯高于NC組〔(1.53±0.34)g、(0.73±0.12)g、(5.11±0.39)〕，RC組肺組織濕重〔(2.11±0.36)g、干重(1.22±0.27)g和肺系數(8.47±0.38)〕均高于NC組但是顯著低于MO組(P<0.05)。

圖1　各組肺組織病理學改變(HE，×20)

2.2肺組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量MO組中Ⅰ型膠原含量〔(82.28±0.36)%〕明顯高于NC組〔(32.15±2.21)%〕，RC組中Ⅰ型膠原含量〔(46.15±0.36)%〕高于NC組但明顯低于MO組。MO組中Ⅲ型膠原含量〔(14.37±0.35)%〕明顯低于NC組〔(31.63±2.37)%〕，RC組中Ⅲ型膠原含量〔(27.38±0.3)%〕明顯低于NC組但明顯高于MO組(P<0.05)。

2.3RC-3095對GRP和GRPR相互作用的影響MO組中GRP和GRPR相互作用與NC組無顯著差異。說明RC-3095降低了GRP和GRPR的結合。見圖2。

圖2　RC-3095對GRP和GRPR相互作用的影響

2.4RC-3095對GRP、GRPR和TGFβ1蛋白水平的影響RC組、NC組和MO組的GRP蛋白水平無顯著性差異，MO組GRPR蛋白水平高于NC組，RC組GRPR蛋白水平低于MO組，與NC組無顯著性差異。TGFβ1蛋白水平與之相反，MO組TGFβ1蛋白水平低于NC組，RC組TGFβ1蛋白水平高于MO組和NC。見圖3。

圖3　3組GRP、GRPR和TGFβ1蛋白水平

3討論

肺部纖維化是可由多種病因造成的共同現象，目前常見的導致肺部纖維化的原因有吸入SiO2等有毒物質、受到放射性損傷等，肺部纖維化也是導致急性呼吸系統綜合征(SARS)患者死亡的重要原因之一〔4，5〕。肺部纖維化后，炎癥細胞浸潤肺泡組織，纖維細胞聚集，膠原沉積使得肺泡結構組織改變，肺間質增寬，顯微組織和毛細血管增生，繼而無法完成正常肺功能，導致患者死亡〔6〕。Ⅰ型膠原纖維粗，硬度和抗牽拉能力較強，而Ⅲ型膠原纖維較細，具有較好的伸展性和彈性〔7〕，Ⅰ型膠原含量增加而Ⅲ型膠原含量降低說明肺組織纖維化程度增強。

GRP是一種重要的細胞因子，參與促進生長、調節胃腸運動和激素分泌、晝夜節律等生理過程，并且與炎癥反應和癌癥發生發展有關〔8〕。GRP發揮作用主要通過結合其受體GRPR進行。在癌癥治療中，以GRP/GRPR為靶向可以明顯提高藥物的有效靶向傳遞，降低腫瘤耐藥和化療藥物的不良反應，可下調生長因子的水平，抑制血管生成信號通路、調節細胞增殖與凋亡的功能〔9〕。本文說明GRPR蛋白在肺部纖維化中可能發揮著重要作用。

RC-3095是GRP/GRPR通路的拮抗劑，由于RC-3095與GRP具有類似的結合能力，因此可以拮抗GRP與GRPR的結合，目前研究表明RC-3095在多種癌癥中具有抑制細胞增殖，降低炎癥反應的功能，如結腸癌、前列腺癌、胃癌、乳腺癌和胰腺癌等，同時也有化學預防劑的功能〔10〕。本文說明RC-3095可以有效地抑制肺部纖維化。RC-3095可以有效抑制肺纖維化大鼠中GRPR蛋白表達水平，但是對GRP蛋白水平無顯著影響，此外RC3095降低了GRPR和GRP的相互作用。肺纖維化過程包括肺組織的炎性損傷、組織結構破壞及隨后伴有肺間質細胞積聚的組織修復過程。這個過程中有多種細胞因子參與，TGFβ1是目前已知的最強的致纖維化因子〔11〕，RC-3095可以通過調節GRP和GRPR的結合能力及TGFβ1的蛋白水平抑制肺部纖維化。

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〔2014-07-06修回〕

(編輯苑云杰)

基金項目：江蘇省衛生廳指導性科研課題(No.Z201310)

中圖分類號〔〕R563.9〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6039-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.015