水溶性殼聚糖對缺血再灌注損傷大鼠心肌的作用

張二偉　馬佳男　費　瑜　桑　翠　任彥鋒

(吉林大學第二醫院心內科，吉林　長春　130041)

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水溶性殼聚糖對缺血再灌注損傷大鼠心肌的作用

張二偉馬佳男1費瑜桑翠任彥鋒2

(吉林大學第二醫院心內科，吉林長春130041)

摘要〔〕目的探討水溶性殼聚糖(WSC)對心肌缺血再灌注損傷(IRI)大鼠心肌的作用機制。方法將60只SD大鼠隨機分為假手術組、IRI模型組、低劑量WSC組、中劑量WSC組、高劑量WSC組，每組 12只。其中，IRI模型組和各劑量WSC組大鼠用結扎左冠脈前室間支法建立大鼠IRI模型，假手術組大鼠僅分離而不結扎左冠脈前室間支。假手術組和IRI模型組給予生理鹽水10 ml/kg、低、中、高劑量WSC組分別給予120、180 mg/kg和240 mg/kg，灌胃1次/d，15 d后處死大鼠，心臟取血，分離血清，用酶聯免疫吸附(ELSIA)法檢測血清中起氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、白細胞介素(IL)-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平，用酶動力法檢測肌酸激酶(CK)和低密度脂蛋白(LDH)水平。在靠近心尖部1/3處平行于房室溝橫行切取心肌組織塊，固定后石蠟包埋。用蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察心肌組織形態變化。結果光鏡下觀察，假手術組心肌纖維排列整齊，結構清楚，細胞核染色清晰，心肌間質未見炎性細胞浸潤；IRI模型組大鼠心肌纖維紊亂，界限不清，胞質淡染，核有濃縮或溶解，大量炎性細胞浸潤，充血淤血，心肌纖維橫紋消失，心肌組織灶性壞死；WSC干預組肌纖維偶有斷裂、融解現象，少量心肌細胞顆粒變性、水腫，偶見炎性細胞浸潤。與假手術組相比，IRI模型組SOD水平明顯下降，而CK、LDH、 MDA、IL-6和TNF-α水平明顯升高(P<0.01)；與IRI模型組比較，低劑量WSC組、中劑量WSC組和高劑量WSC組可顯著提高SOD水平，降低CK、LDH、 MDA、IL-6和TNF-α水平(P<0.05，P<0.01)。結論WSC逆轉心肌IRI，對IRI大鼠心肌具有保護作用。這種作用可能與對抗IRI時氧化應激和炎癥反應有關。

關鍵詞〔〕超氧化物歧化酶；丙二醛；白細胞介素-6；腫瘤壞死因子-α

1吉林大學臨床醫學院2新鄉市中心醫院心內科

第一作者：張二偉(1991-)，男，在讀碩士，主要從事心血管疾病基礎與臨床研究。

心肌缺血再灌注損傷(IRI)的發病機制與氧化應激和炎癥反應有極其密切的關系，藥物可通過對抗氧化應激和炎癥反應來防止心肌IRI〔1～3〕。水溶性殼聚糖(WSC)是甲殼素脫乙酰基的產物，具有抗氧化和抗炎等方面作用〔4～7〕。但目前有關WSC能否防治心肌IRI的文獻報道甚少。本文制作大鼠心肌IRI模型，并用WSC進行干預，旨在探討WSC對IRI大鼠心肌的作用及其機制，為藥物防治心肌IRI提供實驗依據。

1材料與方法

1.1實驗材料健康雄性清潔級SD大鼠，吉林大學白求恩醫學院動物中心提供〔動物合作證號SCXX(吉)2010-0005〕，體重(250±10)g。飼養條件：室溫18℃～25℃，相對濕度 40%～60%，每日正常光照，空氣流通，自由攝食、飲水，所有大鼠實驗前在室內給予標準飼料常規飼養2 d，實驗前稱重，禁食12 h。

UltraCutE 超薄切片機(奧地利衛永儀器公司)，顯微鏡(日本JEOL公司)，酶標測定儀(日本 MODEL550)，小動物人工呼吸機(成都泰盟科技有限公司)，全自動生化分析儀(日立)WSC(青島海普生物技術有限公司，溶解度為125，脫乙酰度54.73%)，大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒(北京邦定泰克生物技術有限公司)。

1.2實驗方法按文獻報道方法建模：麻醉，仰臥固定手術臺上，連接小動物人工呼吸機和心電圖機。剪開心包膜，暴露心臟，左手拇食指輕壓胸廓把心臟擠出，于左心耳下方2 mm處，用10/0號無損傷縫合針穿線，進針深度為1.5～2 mm，寬為2～3 mm，適應5 min，在縫合線與左冠脈前室間支血管間墊于一細小塑料管(直徑約1.0 mm)，結扎時用活結結扎。同步觀察心電圖變化，當出現ST段抬高與高聳T波融合呈弓背向上單向曲線為左室游離壁缺血成功的標志。結扎30 min后剪去膠管使缺血再灌通，再灌通時間為120 min。再通后心電圖形表現為缺血圖形減輕或出現病理性Q波，當抬高的ST段下降1/2以上者，以此圖形作為心肌IRI標準，符合標準者即為心肌IRI造模成功并入選實驗。假手術組僅分離左冠脈前室間支，并穿線不結扎。

將60只大鼠隨機分為假手術組、IRI模型組、低劑量WSC組、中劑量WSC組和高劑量WSC組，每組12只。假手術組和IRI模型組分別給予生理鹽水10 ml/kg、低、中、高劑量WSC組分別給予120、180 mg/kg和240 mg/kg，灌胃1次/d，連續15 d。各組分別于實驗結束后處死大鼠，心臟取血，分離血清，用酶聯免疫吸附(ELSIA)法檢測血清中SOD、MDA 、TNF-α和IL-6水平。用酶動力法檢測肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)水平。在靠近心尖部1/3處平行于房室溝橫行切取心肌組織塊，放入4% 多聚甲醛溶液，固定24 h，石蠟包埋。用蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察心肌組織形態變化。

2結果

2.1大鼠心肌組織形態學觀察光鏡下觀察，假手術組心肌纖維排列整齊，結構清楚，細胞核染色清晰，心肌間質未見炎性細胞浸潤；IRI模型組大鼠心肌纖維紊亂，界限不清，胞質淡染，核有濃縮或溶解，大量炎性細胞浸潤，充血淤血，心肌纖維橫紋消失，心肌組織灶性壞死；WSC干預組肌纖維偶有斷裂、融解現象，少量心肌細胞顆粒變性、水腫，偶見炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1　大鼠心肌組織形態學變化(HE，10×40)

2.2WSC對IRI大鼠血清CK和LDH水平的影響與假手術組〔(887.24±156.32)U/L〕相比，IRI模型組CK的水平〔(2 023.57±861.71)U/L〕明顯升高(P<0.01)；與IRI模型組比較，低劑量WSC組〔(1 514.23±716.38)U/L〕、中劑量WSC組〔(1 492.91±544.25)U/L〕和高劑量WSC組〔(1 134.52±479.28)U/L〕的CK水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)。與假手術組〔(799.84±98.54)U/L〕相比，IRI模型組LDH的水平〔(1 763.55±162.15)U/L〕明顯升高(P<0.01)；與IRI模型組比較，低劑量WSC組〔(1 287.29±136.32)U/L〕、中劑量WSC組〔(1 195.96±125.17)U/L〕和高劑量WSC組〔(1 012.17±101.25)U/L〕的LDH水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)。

2.3WSC對IRI大鼠血清SOD、MDA、IL-6和TNF-α水平的影響，與假手術組相比，IRI模型組SOD水平下降，而MDA、IL-6和TNF-α水平明顯升高(P<0.01)；與IRI模型組比較，低劑量WSC組、中劑量WSC組和高劑量WSC組可顯著提高SOD水平，降低MDA、IL-6和TNF-α水平(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1　WSC對IRI大鼠血清SOD、MDA、IL-6和

與假手術組比較：1)P<0.01；與IRI模型組比較：2)P<0.05；3)P<0.01

3討論

在生理狀態下機體內的活性氧簇對機體有一定的保護作用，當較多的活性氧簇產生后，機體多數組織器官可通過抗氧化系統清除活性氧簇，使機體結構和功能維持在穩定的平衡狀態。SOD是機體內清除活性氧簇的一種金屬酶，能使生物體內過氧化物轉化成過氧化氫和氧，其活性的高低可間接反映體內自由基的濃度。MDA是膜脂質不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應產物，是反映氧化損傷的指標。已有報道，IRI時大鼠心肌纖維紊亂，界限不清，胞質淡染，核有濃縮或溶解，大量炎性細胞浸潤，充血淤血，心肌纖維橫紋消失，心肌組織灶性壞死，血清 SOD水平明顯下降、CK、LDH、MDA水平明顯升高〔1，2〕，提示SOD和MDA與心肌IRI有關。本實驗結果與文獻報道一致，進一步證實氧化應激參與心肌IRI病理過程的結論。IRI時由于黃嘌呤氧化酶形成增多、中性粒細胞呼吸爆發等原因使得活性氧簇增多，這些過多活性氧簇本應由機體清除，但由于此時SOD的能力下降，結果導致活性氧簇大量堆積，造成機體進一步損傷。因此SOD活性降低是導致心肌IRI的主要原因。

IRI時體內產生大量活性氧簇可從以下幾方面對機體損傷：(1)破壞生物膜的結構，使不飽和脂肪酸與蛋白質比例失調，細胞膜和細胞器膜的液態性及流動性降低，進而導致通透性增加，鈣離子內流增加。另外，還能間接地抑制膜蛋白功能，進而影響離子通道的正常功能。上述變化引起膜電位不穩定，觸發嚴重的心律失常；(2)使細胞結構蛋白質和酶氧化，使其功能下降；(3)使細胞內DNA斷裂，染色體變異；(4)激活血小板環氧化酶，生成TXA2，促進血栓形成；(5)線粒體膜損傷，使其功能障礙，ATP合成減少。

再灌注時的炎癥反應貫穿于IRI的全過程，促進了心肌繼發性損害，是心肌IRI的主要原因之一。IL-6、TNF-α是重要的炎癥遞質，它們主要是由單核巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和內皮細胞產生，具有吸引和激活上述細胞，可誘導機體炎癥反應。鐘偉等〔3〕對IRI大鼠的炎癥因子進行觀察，發現IRI時炎癥因子升高；孫莉等〔2〕發現IRI時炎癥因子變化與心室功能和心肌損傷程度相平行。本實驗與文獻報道一致，證實心肌缺血再灌注給機體造成損傷，這一過程與炎癥反應有關。

IRI時體內TNF-α和IL-6可從以下幾方面對機體損傷：(1)炎癥反應因子促進中性粒細胞及黏附分子激活與表達，介導與心肌細胞結合，損傷心肌；(2)炎癥反應中可生成大量的氧自由基，造成心肌進一步損傷〔8〕；(3)炎癥遞質誘導中性粒細胞黏附穿過內皮遷移至心肌缺血部位，可阻塞毛細血管，使心肌微循環的損傷程度加重，誘導心肌細胞凋亡，增大梗死面積。

殼聚糖是一種白色或灰白色無味、無毒、略帶珍珠光澤、半透明的片狀或粉狀固體，它分子呈線狀，極性強，易結晶。它不溶于水和堿性溶液，但可溶于酸性溶液，當它與稀酸作用時呈黏糊狀，帶正電荷且慢慢水解，故殼聚糖一般是隨用隨配。WSC是殼聚糖脫乙酰反應的產物，在無需其他化學修飾的情況下就能夠溶于水中因而它獨特的生理活性和物化性質更容易得到體現，且保留原殼聚糖的生物學功能〔9〕。Hou等〔7〕研究發現WSC能促進成骨細胞功能，如堿性磷酸酶活動，細胞生存能力和礦化，這一過程是通過抗氧化活性進而減少或防止成骨細胞變性來實現的。Chung等〔10〕發現WSC有抑制過敏性哮喘炎癥反應的作用。本實驗說明WSC能逆轉心肌IRI，對IRI大鼠心肌具有保護作用。這種作用可能與對抗IRI時氧化應激和炎癥反應有關。目前有關WSC抗IRI時氧化應激和炎癥反應的機制還不清楚，有待于進一步研究。

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9Ma JX，Qian L，Zhou Y.Stimulation effect of chitosan on the immunity of radiotherapy patients suffered from lung cancer〔J〕.Int J Biol Macromol，2015;72(2)：195-8.

10Chung MJ，Park JK，Park YI.Anti-inflammatory effects of low-molecular weight chitosan oligosaccharides in IgE-antigen complex-stimulated RBL-2p cells and asthma model mice〔J〕.Int Immunopharmacol，2012;12(2)：453-9.

〔2015-06-19修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

通訊作者：任彥鋒(1987-)，男，碩士，主要從事心血管疾病基礎研究。

基金項目：吉林省自然科學基金資助(201215058)

中圖分類號〔〕R541.4〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6056-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.022