針刺四神聰、百會對失眠大鼠腦組織鐘基因及氨基酸類神經遞質表達的影響

劉振華　王世軍

(山東大學附屬省立醫院神經內科　山東省睡眠醫學中心，山東　濟南　250021)

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針刺四神聰、百會對失眠大鼠腦組織鐘基因及氨基酸類神經遞質表達的影響

劉振華王世軍1

(山東大學附屬省立醫院神經內科山東省睡眠醫學中心，山東濟南250021)

摘要〔〕目的探究針刺四神聰、百會對失眠大鼠腦組織鐘基因及氨基酸類神經遞質表達的影響。方法成年Wistar大鼠50只，隨機分為手針組、電針組、陽性藥組、模型組及對照組，每組各10只。采用弱堿性生理鹽水配置成混懸液的氯苯丙氨酸(PCPA)腹腔注射建立失眠模型，按45 mg/100 g的用量，1次/d，連續2 d，造模成功后，手針組大鼠固定，用規格為30號的1寸毫針針刺百會及四神聰穴，平補平瀉，15 min行針1次，共留針30 min。電針組取相同穴位，給予電針刺激，電壓為9 V，選擇疏密波，以實驗大鼠頭部輕擺動為度，共30 min。連續7 d。陽性藥組腹腔注射地西泮0.9 mg/kg，1次/d。模型組及對照組大鼠不給予任何實驗措施，均連續7 d。干預結束后PCR法檢測大鼠的鐘基因表達，離子色譜儀檢測下丘腦Glu、GABA水平，HE染色觀察下丘腦形態學改變。結果治療后，治療各組大鼠的鐘基因相關指標表達水平均明顯改善，與模型組相比差異顯著(P<0.05)；與手針組相比，電針組鐘基因各指標改善更為明顯(P>0.05)；(1)治療后，治療各組大鼠的下丘腦Glu、GABA水平明顯改善，與模型組相比差異顯著(P>0.05)；與手針組相比，電針組的下丘腦Glu、GABA水平改善更為顯著(P<0.05)。(2)對照組大鼠下丘腦神經細胞豐富，各種細胞均清晰可見，且均勻分布，細胞結構完整，排列緊密；模型組大鼠下丘腦細胞形變嚴重，大量細胞空泡，排列疏松，細胞界限模糊；治療各組可見丘腦核團細胞大量恢復，細胞排列較整齊，細胞空泡明顯減少，偶見萎縮細胞，其中電針組下丘腦細胞恢復更為顯著。結論針刺四神聰、百會能夠明顯改善失眠大鼠腦組織鐘基因及氨基酸類神經遞質表達水平，對臨床有指導意義。

關鍵詞〔〕針刺；失眠；鐘基因；氨基酸類神經遞質

1山東中醫藥大學中西醫結合基礎學院

第一作者：劉振華(1964-)，男，博士，主任醫師，主要從事腦血管病、睡眠障礙、癲癇研究。

失眠(SD)是指入睡障礙和睡眠維持障礙，又稱為睡眠障礙，SD患者睡眠質量較差，無法滿足個體生理需要，從而影響白天活動的一種睡眠障礙綜合征〔1〕。難于入睡和睡眠維持困難是其主要特點，長期失眠會嚴重影響工作生活，還可誘發心、腦等疾病，甚至導致心理疾病，嚴重者還可引發自殺傾向和意外事故等〔2〕。中醫稱SD為“不寐”、“不得臥”、“不得眠”等，主要是由于臟腑功能失調，陰陽失衡、氣血瘀阻而無法獲得正常睡眠。SD的主要病因病機是“陽不入陰，陰陽失調”，故其主要治則為調和陰陽，中醫根據辨證論治，通過“補虛瀉實”手段以達到“陰平陽秘，精神乃治”的目的〔3〕。針灸治療效果頗佳，其優點為安全高效、簡單易行、無副作用、無依賴等，現已廣泛為患者所接受〔4〕。本實驗對SD大鼠行針刺干預，通過觀察大鼠腦組織鐘基因及氨基酸類神經遞質的表達，探究針刺四神聰、百會治療SD的療效。

1材料與方法

1.1實驗動物成年Wistar大鼠50只(廣州中醫藥大學動物中心提供，No.0055714)，SPF級，雄性，體重200～230 g，在相同飼養條件下飼養，自然光照，40%～60%濕度，自由進食水。

1.2儀器及試劑氯苯丙氨酸(PCPA，阿法埃莎公司)、光學顯微鏡、冷凍離心機、血糖(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)標準品(美國Sigma公司)、G6805-2型電針儀(蘇州醫療用品廠)、ICS-2500型離子色譜儀(美國戴安公司)、Trizol逆轉錄試劑盒、異丙醇、無水乙醇、氯仿、實時熒光定量PCR試劑盒。

1.3實驗方法

1.3.1模型的建立隨機選取40只大鼠，將PCPA用弱堿性生理鹽水配置成混懸液，pH7～8，按45 mg/100 g的用量腹腔注射，1次/d，連續2 d，建立SD大鼠模型。其余大鼠腹腔注射2 ml生理鹽水。大鼠出現活動頻繁、晝夜節律混亂、興奮性及攻擊性增強、飲食及二便明顯不規律，表明造模成功。

1.3.2分組和用藥造模成功大鼠隨機分為手針組、電針組、陽性藥組、模型組，每組各10只；其余10只未建立模型大鼠為對照組。從造模成功開始，手針組大鼠固定，用規格為30號的1寸毫針針刺百會及四神聰穴。取穴參照《實驗針灸學》〔5〕大鼠穴位的定位方法，四神聰穴為百會穴的前、后、左、右各旁開5 mm。向后平刺4 mm，手法為平補平瀉，15 min行針1次，共留針30 min。電針組取相同穴位，取穴法同前，將大鼠固定，給予電針刺激，電壓為9 V，選擇疏密波，以實驗大鼠頭部輕擺動為度，共30 min。連續7 d。其余各組大鼠在同一時間均固定，陽性藥組腹腔注射地西泮(安定)，劑量為0.9 mg/kg，1次/d。模型組及對照組大鼠不給予任何實驗措施，均連續7 d。

1.4檢測指標及觀察方法

1.4.1PCR法檢測鐘基因表達水平所有大鼠于末次給藥12 h后，麻醉，固定，以矢狀縫為縱軸，剪開顱頂骨及硬腦膜，從聯合竇下取出松果體，-80℃保存待檢。將組織研碎，加入1 ml TRIzol，反復吹打混勻，加入氯仿，振蕩后離心。加入異丙醇后混勻，重復離心步驟，去上清，嚴格按照說明書步驟進行逆轉錄，上樣，電泳。凝膠成像系統下觀察條帶的情況。引物序列見表1。

表1　鐘基因的引物序列

1.4.2下丘腦Glu、GABA含量的檢測實驗結束后各組大鼠開顱取整個腦組織，分離下丘腦，洗去血液后加入生理鹽水進行勻漿，2 000 r/min離心5 min，取上清，采用離子色譜儀檢測下丘腦Glu、GABA含量，并計算其比值。激發波長為340 nm，發射波長450 nm。流量：1 ml/min，柱溫40℃。

1.4.3下丘腦形態學觀察將各組大鼠下丘腦用甲醛固定，脫水、石蠟包埋、切片、染色，在光鏡下觀察其組織形態學變化。

1.5統計學方法應用SPSS19.0軟件，計量資料采取t檢驗，計數資料運用χ2檢驗。

2結果

2.1各組大鼠鐘基因水平比較治療后，治療各組大鼠的Clock、Bmal1、Per1基因表達水平均明顯改善，與模型組相比差異顯著(P<0.05)；與手針組相比，電針組鐘基因各指標改善更為明顯(P<0.05)；手針組與陽性藥組無統計學差異(P>0.05)。見表2，圖1。

表2　各組大鼠Clock、Bmal1、Per1水平比較

與模型組相比：1)P<0.05；與手針組相比：2)P<0.05；下表同

1.對照組；2.模型組；3.手針組；4.電針組；5.陽性藥組圖1　各組大鼠鐘基因水平比較

2.2各組大鼠Glu、GABA水平比較治療后，治療各組大鼠下丘腦Glu水平明顯降低，GABA水平明顯升高，與模型組相比差異顯著(P>0.05)；與手針組相比，電針組的下丘腦Glu、GABA水平改善更為顯著(P<0.05)。見表3。

表3　各組大鼠下丘腦Glu、GABA水平比較

圖3　各組大鼠下丘腦病理切片(HE)

2.3各組大鼠下丘腦病理切片對照組大鼠下丘腦神經細胞豐富，各種細胞均清晰可見，且均勻分布，細胞結構完整，排列緊密；模型組大鼠下丘腦細胞形變嚴重，大量細胞空泡，排列疏松，細胞界限模糊；治療各組可見丘腦核團細胞大量恢復，細胞排列較整齊，細胞空泡明顯減少，偶見萎縮細胞，其中電針組下丘腦細胞恢復更為顯著。見圖3。3討論

睡眠是維持正常人身體健康、機體復原、鞏固記憶的重要過程。正常人生命三分之一的時間處在睡眠過程，因此睡眠是人的生理過程中必不可少的組成部分。失眠又稱睡眠障礙，嚴重威脅身體健康和日常生活、工作。我國睡眠研究會最新的流行病學調查統計顯示，我國成年人的SB發生率高達38.2%〔6〕。祖國醫學采用針刺治療SB，具有操作簡便、療效突出且副作用小的特點〔7〕。本實驗結果表明，針刺四神聰、百會能夠明顯改善SB大鼠腦組織鐘基因及氨基酸類神經遞質表達水平，抑制SB癥狀的發生和發展，對臨床有指導意義。

有研究表明〔8〕，調控生物節律的生物鐘基因與睡眠的關系密切。在自然狀態下，生物鐘接受外界的溫度、光線等信號，調整人體以適應外界環境。目前國內外研究確認的鐘基因成分包括Clock、BmalK、CryK、Cry2、Perl、Per2、Per3等，主要集中于下丘腦前部松果體。其中Clock基因控制睡眠的穩態，其突變可以導致睡眠減少和神經高度興奮〔9〕。實驗表明，SB模型大鼠的Clock基因水平明顯降低。針刺可降低神經的應激功能，到達鎮靜的作用。本實驗結果表明，針刺可調控鐘基因，從而治療；并且通過持續的穴位電流刺激能夠更好地達到調控鐘基因、鎮靜以治療SB的作用。

睡眠與覺醒涉及復雜的神經生理過程，多種神經遞質均參與其調控〔10〕。研究表明，睡眠障礙患者的中樞神經系統處于抑制狀態，與中樞神經系統內的抑制性氨基酸與興奮性氨基酸神經遞質的動態平衡被打破關系密切，通常變現為前者的增多和后者的減少〔11〕。GABA、Glu的改變在睡眠的調節過程中發揮了重要作用。Glu是主要的興奮性神經遞質，含量較高，參與了有關細胞凋亡、學習和記憶的過程。在下丘腦中，幾乎所有的神經元中都含有Glu受體，Glu含量升高會引起神經興奮，從而導致SB的發生。實驗結果表明，針刺能夠明顯降低下丘腦中的Glu含量，表明針刺能夠通過調控Glu的水平，降低神經的興奮性，從而治療SB。GABA是一種非蛋白質性氨基酸，是重要的抑制性神經遞質，對大部分的神經元均有抑制作用。研究表明〔12〕，GABA在睡眠過程發揮著重要的調節作用。另有研究表明〔13〕，在睡眠過程中大腦皮層內釋放的GABA是清醒時的3倍。因此，GABA含量減少會導致SB的發生。實驗結果表明，失眠大鼠經針刺干預后，GABA含量明顯升高，提示針刺治療能夠明顯促進神經遞質對神經元的抑制作用，降低神經的興奮性，從而抑制失眠的發生；而電針通過穴位上的持續電流刺激能夠更好地達到治療SB的效果。

綜上所述，針刺四神聰、百會能夠明顯改善失眠大鼠腦組織鐘基因及氨基酸類神經遞質表達水平，對臨床有指導意義。

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13鄧麗華.腦卒中后覺醒障礙〔J〕.中國現代神經疾病雜志，2013；13(6)：476-80.

〔2015-03-11修回〕

(編輯袁左鳴)

通訊作者：王世軍(1963-)，男，教授，博士生導師，主要從事腦微循環研究。

中圖分類號〔〕R245〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6067-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.027