鐵引起認知相關缺損的機制及干預

劉國生　李丹丹　鄭　晗　周　維　王曉亮　鄭建瓊

(湖北民族學院附屬民大醫院醫學檢驗科，湖北　恩施　445000)

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鐵引起認知相關缺損的機制及干預

劉國生李丹丹1鄭晗1周維王曉亮鄭建瓊

(湖北民族學院附屬民大醫院醫學檢驗科，湖北恩施445000)

摘要〔〕目的探討老年性癡呆等神經退行性疾病患者大腦中神經元煙堿型膽堿能受體(nAchRs)的丟失是否與異常增高的腦鐵有關，以及鐵神經毒性的作用機制，尋求預防途徑。方法建立鐵致神經元損傷模型，采用TBARS，MTT,Annexin-V以及配體結合實驗方法，觀察PC12細胞在鐵侵害早期細胞損傷的機制及抗氧化劑的保護作用。結果硫酸亞鐵(FeSO4)在低濃度(1～100 μmol/L)范圍引起細胞膜脂質過氧化和細胞毒性作用呈劑量依賴性增加，但不引起明顯可見的凋亡和壞死。與對照組比較，該濃度范圍可引起〔125I〕 α-Bungarotoxin結合位點明顯減少，但預先用抗氧化劑處理，可阻止鐵對〔125I〕 α-Bungarotoxin的親和力。結論鐵誘導氧化應激，能降低〔125I〕 α-Bungarotoxin結合位點數量，這些改變發生在PC12細胞損害早期階段。鐵與氧化應激對nAchRs的損傷可早于凋亡和壞死的過程，可能發生在神經退行性病程的早期。直接降低腦鐵濃度及抑制活性氧化物質的產生應是預防和治療認知缺損相關神經退行性疾病的一個方向。

關鍵詞〔〕煙堿型膽堿能；老年性癡呆；鐵氧化應激

1湖北民族學院附屬民大醫院神經內科

第一作者：劉國生(1982-)，男，主管檢驗師，碩士在讀，主要從事臨床檢驗研究。

神經元煙堿型膽堿能受體(nAchRs)在大腦認知功能中起主要作用〔1,2〕。值得注意的是在一些中樞神經退行性疾病如阿爾茨海默病(AD),帕金森病(PD)和精神分裂癥患者中nAchRs功能缺乏，含nAchRs的神經元大量丟失是這些疾病的主要病因之一，尤其是AD其臨床表現主要為記憶力進行性減退和認知功能障礙，中樞膽堿能系統功能減退發生最早，最明顯〔3〕。但迄今為止nAchRs缺失的病因和發病機制，仍不清楚。近年來研究表明，腦鐵代謝異常，可引起許多腦部疾病。在AD、PD患者腦內的基底神經節和老年斑中，鐵含量異常增高,并存在氧化應激狀態〔4,5〕。腦部鐵濃度升高可導致鐵氧化應激和抗氧化保護機制的缺失，可能是神經元變性死亡的原因之一。但關于鐵對nAchRs毒性作用的研究，在國內尚未見報道。本研究利用鐵作為誘導劑直接觀察早期神經元損傷機制，以及抗氧化劑對神經元的保護作用。

1材料與方法

1.1材料MTT、(sigma公司)、硫巴比妥酸，硫酸亞鐵、維生素E(VitE)、還原型谷胱甘肽(GSH)購于上海第六制藥廠。Annexin-V-Fluos 染色試劑盒購于(Boehringer-Mannheim,德國)。

1.2細胞培養PC12細胞生長在含RPMI1640培養液，含2 mmol/L谷維素、10%滅活馬血清、5%小牛血清和2.5 μ/ml青-鏈霉素、培養皿預先涂有鼠尾膠，細胞培養皿置于37℃含5%CO2濕氣培養箱中。

1.3抗氧化保護實驗10 mmol/L硫酸亞鐵(FeSO4)儲備液含0.5% H2SO4維持溶液Fe2+狀態〔6〕。分別加入不同濃度FeSO4誘導處理PC12細胞脂質過氧化96 h。培養細胞預先用20 mmol/L VitE或2 mmol/L GSH處理細胞后，暴露于100 μmol/L FeSO4孵育96 h。

1.4硫代巴比妥酸反應物(TBARS)檢測用硫巴比妥酸反應物檢測分析法〔7〕檢測培養液中丙二醛(MDA)含量。細胞并離心收集上清加入三氯醋酸(TCA)至4.5% TCA的混合，然后，加入兩體積的TBARS試劑(含0.45%TCA和12%醋酸)混合后，在90℃溫度孵育60 min，用波長532 nm的光譜儀，檢測上清液中TBARS的含量。

1.5MTT遞減分析對數生長期PC12細胞鋪在96孔板內細胞密度為5 000細胞/孔，加入10% 透析了的胎牛血清 ，次日換液，換入含不同鐵離子濃度的培養液。連續培養96 h，每孔加入10 μl 5 mg/ml MTT貯存液孵育4 h后，每孔加入100 μl溶液(20%SDS和50%二甲基亞砜(pp.8)過夜，570 nm波長測得吸收率〔8〕。

1.6凋亡和壞死分析采用Annexin-V-FLUOS 染色試劑盒進行凋亡和壞死分析實驗，用FeSO4處理5×105對數生長期的細胞96 h后，置于100 μl標記溶液，內含1 μl Annexin-V(標記凋亡)和1 μl PI標記壞死。室溫下，孵育15 min，隨機性對照。但加入2 μmol/L Staurosporine孵育3 h誘導凋亡〔3〕，細胞用FACScan 流式細胞儀進行分析。

1.7〔125I〕 α-Bungarotoxin(α-BTX)配體結合實驗〔125I〕 α-BTX(260 Ci/mmol)結合實驗。粗膜制備，離心，取上清測定其蛋白含量，粗膜混懸液(100 μg)與2 nmol/L〔125I〕 α-BTX，25℃共同孵育30 min。清洗、離心，微管底部沉淀物在COBRA γ計數器計數(Packard Instrument,Meridian,CT)。另加入1 μmol/L放射性核素未標記的α-BTX，確定非特異性結合力。

1.8統計學分析應用SPSS10.0軟件行t檢驗。

2結果

2.1TBARS變化加入不同濃度(10～1 000 μmol/L)FeSO4與PC12細胞共同孵育96 h后，TBARS量呈濃度依賴性遞增。見表1。

2.2細胞活性和神經細胞毒性測定FeSO4處理96 h后，細胞活性明顯下降，隨FeSO4濃度呈依賴性遞減20%～80%。見表1。

2.3自由基誘導劑導致培養細胞凋亡或壞死的濃度測定將PC12細胞分別用不同濃度的FeSO4處理PC12細胞，當FeSO4濃度低于200 μmol/L時，未檢測出凋亡細胞，而當細胞暴露在高濃度500～1 000 μmol/L的FeSO4時，出現凋亡細胞(表2)。自由基誘導劑引起細胞壞死，結果也與上述情況相同(表2)。Staurosporine已證明為凋亡誘導劑〔9〕。在本研究中作為陽性對照。2 μmol/L Staurosporine處理PC12細胞3 h，明確誘導細胞凋亡而不是壞死，也無脂質過氧化，為一個可靠的檢測PC12細胞凋亡的方法。

表1　不同濃度FeSO4作用后的

表2　不同濃度FeSO4作用后細胞凋亡或壞死濃度的變化(%)

2.4FeSO4誘導PC12細胞損害早期〔125I〕 α-Bungarotoxin(αBTX)結合位點的變化與對照組(27.01 fmol/mg)比較，100 μmol/L FeSO4處理后的PC12細胞其〔125I〕 α-Bungarotoxin(α-BTX)結合位點下降33%(18.11 fmol/mg,P<0.05),1 μmol/L FeSO4和10 μmol/L FeSO4處理組分別下降6%(25.39 fmol/ml)和15%(22.96 fmol/mg)，但與對照組相比無顯著差異P>0.05〕，而單獨用VitE和GSH處理PC12細胞，其〔125I〕 α-Bungarotoxin(αBTX)結合力未見改變(資料未提供)然而，預先用VitE和GSH分別處理PC12細胞可以干預其誘導的〔125I〕 α-Bungarotoxin(αBTX)結合位點的下調，其中對照組結合焦點為27.01 fmol/mg，單獨FeSO4結合位點為14.03 fmol/mg，預先Vit E、GSH分別處理后為25.61、22.76 fmol/mg。

3討論

腦組織是體內氧負荷最大的器官，氧化應激、自由基產生和抗氧化防御系統失衡是導致AD、PD的原因之一。

鐵的致氧化損傷作用愈來愈引起人們的關注。正常情況鐵分布于整個腦組織中，但其分布不均勻。基底神經節中含量最高并隨年齡增加，對腦組織功能活動極為重要。鐵是電子傳遞者，是線粒體氧化和氧運輸不可缺少的物質，腦鐵代謝平衡對維持正常腦功能尤其是認知功能必不可少。近年來研究顯示AD等基底神經節疾病鐵沉積增多,腦組織氧化損傷程度與局部腦鐵直接相關〔10〕，這種腦鐵的增加是否是疾病的起因,一直未有定論。

本研究表明細胞膜對鐵的致氧化損傷十分敏感,與有關腦鐵代謝紊亂是一些中樞退行性疾病的始發因素的觀點一致。通過與過氧化氫和氧的反應，游離鐵可引發脂質過氧化和細胞膜的損傷最終導致細胞死亡〔6〕。MDA水平反映細胞膜脂質過氧化程度，本研究條件下，培養的細胞暴露在10～100 μmol/L FeSO4中96 h，MDA水平是濃度依賴性遞增，MTT分析細胞死亡率亦呈濃度依賴性遞減。

在PC12細胞MTT降解率下降是自由基誘導損害的一個早期特異性指征〔7〕。細胞死亡經由凋亡或壞死，細胞膜磷脂倒置是鑒別神經元凋亡初期的改變〔8〕。本研究結果表明游離鐵暴露致細胞膜磷脂發生倒置，但只有較高濃度的鐵離子(500～1 000 μmol/L)才引起細胞早期凋亡與Kruman等〔8〕結果一致，500 μmol/L以上才出現細胞壞死。與凋亡、壞死相比，PC12細胞暴露較低濃度(1～200 μmol/L)FeSO4也能引起MTT下降，表明MTT分析可作為檢測早于凋亡、壞死發生之前細胞損害的敏感性指標。更重要的是，它可作為自由基損害nAchRs早期相對特異性的改變，而不是晚期的死亡，由此，揭示了氧自由基引起nAchRs缺損的一個可能機制〔11〕。因此，本研究用低濃度自由基誘導劑FeSO4處理細胞，早在細胞發生凋亡、壞死之前，觀察鐵對nAchRs的損害機制。

細胞膜脂質過氧化將導致膜完整性破壞，多不飽和脂肪酸鏈對于維持細胞膜的流動性是必不可少的，而這些脂肪酸過氧化將增加細胞膜的僵硬程度，由此降低膜受體的活動度。而腦中受體周圍脂質環境可能對自由基更敏感〔12〕。本實驗結果顯示培養的PC12 細胞的〔125I〕 α-Bungarotoxin(α-BTX)和〔3H〕epibatidine結合力下降是由于脂質過氧化環境引起的nAchRs受體早期損害，而不是瀕死細胞的最終結果。如果預先用抗氧化劑處理，可抑制結合位點數量的降低，進一步支持這一觀點。在AD病人腦中N受體的缺損近來引起愈來愈多的關注，α7亞單位在海馬、皮質高密度分布，它們能夠形成同源性單聚體型煙堿受體亞型，明顯參與幾種學習記憶行為〔13〕。

因腦組織中氧利用率高，細胞膜含有豐富的對氧自由基敏感的多聚不飽和脂肪酸，更易遭受自由基介導的損害。與正常衰老組織比較，AD患者腦中海馬、杏仁核、Maynert基底核以及大腦皮層中鐵水平升高，腦組織中自由基產生也增加，而在AD大腦中，nAchRs的大量缺失主要發生在基底前腦、皮質、海馬。有資料證明抗氧化劑，如Vit E 可保護神經元免受氧自由基的損害，減緩AD病程〔14〕。本研究結果同樣也證實Vit E和還原型谷胱甘肽可保護鐵誘導的nAchRs的缺損，由此提示，鐵自由基對細胞膜的攻擊可能是nAchRs缺損的一個機制。盡管氧化應激不是特定因素，但可能是nAchRs結構功能改變的主要原因。進一步探討鐵對腦的功能影響的可能途徑及抗氧化劑的干預作用是今后研究AD等神經退行性疾病的一個方向。

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〔2014-06-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

通訊作者：李丹丹(1987-)，女，護師，主要從事臨床神經退行性疾病護理研究。

中圖分類號〔〕R749〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6070-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.028