內皮型一氧化氮合酶基因G894T多態性與延邊地區冠心病的相關性

樸麗梅　李玉子

(延邊大學附屬醫院,吉林　延吉　133000)

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內皮型一氧化氮合酶基因G894T多態性與延邊地區冠心病的相關性

樸麗梅李玉子

(延邊大學附屬醫院,吉林延吉133000)

摘要〔〕目的探討內皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因G894T多態性與中國延邊地區老年冠心病(CHD)的相關性。方法將研究對象分為正常對照組、CHD組、心肌梗死(MI)亞組，并根據病變累及冠脈血管支數分為單支、雙支和多支病變組。采用聚合酶鏈式反應體外擴增目的基因片段后進行直接測序。結果CHD組、MI亞組與正常對照組基因型、等位基因分布比較差異顯著(P<0.05)；朝鮮族CHD組與漢族CHD組基因型、等位基因分布比較無顯著差異(P>0.05)；單支、雙支與多支病變組基因型、等位基因分布比較無顯著差異(P>0.05)；非MI亞組與MI亞組基因型、等位基因分布比較無顯著差異(P>0.05)。結論eNOS G894T基因多態性與延邊地區老年CHD和MI有關，T等位基因可能是其易感因素。

關鍵詞〔〕冠心??；內皮型一氧化氮合酶；基因多態性

第一作者：樸麗梅(1987-)，女，碩士，主要從事冠心病研究。

冠心病(CHD)與環境因素有關，還與遺傳危險因素有關，如內皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因突變。目前研究證實與CHD關系較為密切的eNOS基因突變有G894T、T786C和4b/a。其中G894T變異于1998年首次被報道與吸煙依賴性冠狀動脈痙攣(CAS)有關〔1〕，近年有對伊朗人群的研究顯示，G894T突變是CHD的一個獨立危險因素〔2〕。在其他不同國家、人群中也有研究顯示其與心肌梗死(MI)有不同程度的關系。但目前尚無中國延邊地區人群的相關報道。本實驗旨在探討eNOS基因G894T多態性與中國延邊地區老年CHD的相關性。

1對象與方法

1.1研究對象2013年4月～7月就診于我院心內科住院病房的受試者63例，年齡≥65周歲。均在住院期間完成冠狀動脈造影檢查,并根據累及冠脈血管支數定義為單只、雙支及多只病變，冠脈狹窄病變累及左主干者記為雙支病變。

1.2主要設備PCR儀，購自美國Bio-Rad公司；人基因組DNA提取試劑盒，購自美國Promega公司；PCR反應試劑，購自美國Promega公司；PCR Marker，購自日本Takara公司。

1.3血樣的采集與處理每位受試者抽取橈動脈血約4 ml,加入含有EDTA-Na2抗凝劑的離心管中。離心吸取中間白細胞層并依次按照細胞裂解、核裂解、去除RNA、沉淀蛋白質的順序提取DNA。

1.4PCR體外擴增目的基因片段PCR引物設計參照Hingorani等〔3〕，上、下游引物分別為：5′-CAT GAG GCT CAG CCC CAG AAC-3′；5′-AGT CAA TCC CTT TGG TGC TCA C-3′。PCR反應條件：預變性95℃，5 min 、變性95℃，30 s、退火59℃，50 s、延伸72℃，40 s、重復35個循環、最后延伸72℃，10 min。擴增產物與Marker一起電泳,可見片段長度為207 bp的擴增產物。見圖1。

M泳道為1 000 bp的Marker,1～10泳道為樣本PCR產物 圖1　瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因擴增產物

1.5目的基因片段的測序目的基因片段擴增產物采用直接測序法，測序結果用Chromas軟件進行分析,與人eNOS基因組第894位點比較，觀察有無突變。

1.6統計學方法采用SPSS19.0軟件進行χ2檢驗。

2結果

2.1Hardy-Weinberg平衡性檢測人eNOS基因位于第7外顯子第894 位點的鳥嘌呤(G)轉換為胸腺嘧啶(T)，導致第298位的密碼子由谷氨酸置換為天冬氨酸(Glu298Asp)，此基因突變前后的等位基因分別稱G、T等位基因，突變后可產生雜合子(GT)和突變純合子(TT)。 各組間基因型分布經χ2檢驗均符合Hardy-Weinberg平衡定律，不存在選擇偏倚。

2.2eNOS基因G894T多態性與CHD、MI的關系CHD組與對照組基因型分布比較顯示GG基因型頻率低、GT+TT基因型頻率高(P<0.05)；等位基因分布比較顯示G等位基因頻率低、T等位基因頻率高(P<0.05)。MI亞組與對照組基因型分布比較顯示GG基因型頻率低、GT+TT基因型頻率高(P<0.05)；等位基因分布比較顯示G等位基因頻率低、T等位基因頻率高(P<0.05)。見表1。

2.3eNOS基因G894T多態性與朝鮮族、漢族CHD的關系朝鮮族CHD組與漢族CHD組基因型分布比較顯示GG基因型頻率低、GT+TT基因型頻率高，但差異無統計學意義(P>0.05)；等位基因分布比較顯示G等位基因頻率低、T等位基因頻率高，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.4eNOS基因G894T多態性與冠狀動脈病變程度的關系單支、雙支與多支病變組基因型分布比較，差異無統計學意義(P>0.05)；等位基因分布比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。MI亞組與非MI亞組基因型分布比較GG基因型頻率低、GT+TT基因型頻率高，差異無統計學意義(P>0.05)；等位基因分布比較G等位基因頻率低、T等位基因頻率高，差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表1　三組各基因型、等位基因分布比較〔n(%)〕

與對照組比較：1)P<0.05

表2　朝鮮族與漢族CHD組各基因型、等位基因

表3　單支、雙支與多支病變組各基因型、等位基因

表4　非MI亞組與MI亞組各基因型、等位基因

3討論

內皮功能受損在冠狀動脈粥樣斑塊形成及發展過程中作用顯著，其釋放的具有抗增生效應的內皮舒張因子中NO表現較為突出。近年研究顯示在“L-精氨酸：NO” 通路中,關鍵酶NOS的一種亞型eNOS，其基因多態性與CHD關系較為密切。G894T突變可導致eNOS基因第298位的谷氨酸錯譯成天冬氨酸, 而此位谷氨酸正處于α-螺旋的中心，錯譯導致eNOS在此處的構象由α-螺旋變為緊密折疊,影響蛋白構型改變致其活性減低〔1〕。魏丹宏等〔4〕發表G894T多態性是導致CHD的一項危險因素。在韓國也有研究顯示相比腦動脈粥樣硬化G894T基因多態性在促進冠狀動脈粥樣硬化中的作用更大〔5〕,且在亞洲人群中這一特性尤為顯著〔6〕。本研究提示在中國延邊地區老年患者中，eNOS基因G894T多態性不僅與CHD有關，而且與MI關系密切。在國內對部分無年齡限制的漢族CHD人群的研究中也發現eNOS基因 G894T多態性中 T等位基因頻率顯著高于正常人〔7〕, GT、TT基因型較易發生MI〔8〕。在MI的臨床治療研究方面〔9,10〕，當外源性eNOS基因轉至體內時NO含量增加，并刺激新生血管形成，且抑制轉化生長因子Beta-1/Smad-2信號途徑，最終對心肌梗死后心臟損傷起到保護作用。 在中國新疆維吾爾族、新疆蒙古族、新疆哈薩克族等同一地區、不同民族人群中eNOS基因G894T多態性不僅與CHD發生有關聯，且其各自攜帶的基因型、等位基因頻率也不盡相同〔11～13〕。而本研究提示eNOS基因G894T多態性在中國延邊地區朝鮮族、漢族CHD之間無明顯差異，無民族特異性。

本研究說明eNOS基因G894T多態性與CHD冠狀動脈病變范圍及冠狀動脈粥樣斑塊穩定性均無關。這與Hingorani等〔3〕的研究結果一致，而與Gardemann等〔14〕的研究結果恰相反。提示有關eNOS基因G894T多態性與冠狀動脈粥樣硬化病變程度的關系在不同國家、種族或民族中或有差異性。

參考文獻4

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13陳春麗，江雪萍.新疆哈薩克族冠心病患者eNOS基因G894T多態性分析〔J〕.臨床和實驗醫學雜志,2010;9(7)：499-500.

14Gardemann A , Lohre J, Cayci S,etal. The T allele of the missense associated with coronary heart disease in younger individuals with high atherosclerotic risk profile〔J〕. Atherosclerosis, 2002;160(1)：167-75.

〔2015-02-11修回〕

(編輯曲莉/滕欣航)

通訊作者：李玉子(1965-)，女，主任醫師，碩士生導師，主要從事冠心病研究。

中圖分類號〔〕R541.4〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6100-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.044