MicroRNA在阿爾茨海默病中的作用及機制

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MicroRNA在阿爾茨海默病中的作用及機制

田金鑫邵水金國海東

(上海中醫藥大學基礎醫學院解剖教研室,上海201203)

關鍵詞〔〕阿爾茨海默病；微RNA；β淀粉樣蛋白

第一作者：田金鑫(1989-)，女，碩士，主要從事電針治療阿爾茨海默病的研究。

微RNA(miRNA)是真核生物中廣泛存在的非編碼RNA，長約21到23個核苷酸，預測轉錄后調節至少一半的人類轉錄組〔1〕。近年來發現，miRNA可能在阿爾茨海默病(AD)等神經退行性疾病的發生發展中發揮重要的調控作用。了解和探討miRNA在AD中的作用及其機制可為臨床尋找特異性的治療靶點提供基礎。

1miRNA的生物學基礎

miRNA的生物合成途徑是高度保守的，每個miRNA的調控靶點大約200個，而一個 mRNA的轉錄可能受多個miRNA調節。許多miRNAs通過轉錄因子或表觀遺傳機制，包括DNA甲基化和組蛋白修飾，受到高度時間和空間上的調節〔2〕。

1.1miRNA的生物合成大部分miRNAs是通過經典的miRNA生物合成途徑產生的。首先，miRNA基因由RNA聚合酶(pol)Ⅱ轉錄，產生長約幾千個堿基的初級轉錄產物(pri-miRNA)。pri miRNAs具有5'端帽和3'端多聚腺苷酸。他們可能編碼一個單一的miRNA，獨特的miRNA簇，或者蛋白質，因此也可以作為前體miRNA〔3〕。下一步，也發生在細胞核內，由微處理器復合物的精密調控。此復合物的主要成分是RNA聚合酶Ⅲ(Drosha)和其結合配偶體DiGeorge氏綜合征關鍵區基因8 (DGCR8)，雙鏈RNA結合蛋白〔4〕。Drosha剪切pri-miRNAs釋放60～70個核苷酸長度的發夾結構，稱為前體miRNAs(pre-miRNA)。Exportin-5介導pre-miRNA將其從核內運輸到胞質中。在胞質中，第二個核糖核酸酶Ⅲ(Dicer)，切割pre-miRNA生成22個核苷酸的雙鏈miRNA。miRNA雙鏈與結合Argonaute(Ago)蛋白結合而迅速解鏈，一股成為成熟的miRNA，并結合到RNA誘導的沉默復合物(RISC)上，通過降解靶mRNAs或阻遏轉錄參與mRNA表達的調控，見圖1。而互補鏈在細胞內的濃度較低，被認為不具有功能，并且可被迅速降解。然而，最近的研究表明，一些互補鏈序列與不同的Ago蛋白復合物結合后也具有活性〔5〕。

圖1　經典的miRNA生物合成途徑

miRNA的產生還包括其他非經典的途徑，在哺乳動物已被確定有四條不依賴于Drosha的途徑，包括mirtron途徑、小核仁RNA、tRNA和短發夾RNA來源途徑〔6〕。在這些途徑中，pri-miRNAs被剪接形成短發夾狀內含子，被稱為mirtrons，然后再被Exportin-5轉運和Dicer剪切〔7〕。mirtrons在靈長類動物的神經系統中發揮重要作用〔8〕。此外，還有兩條不依賴于Dicer的miRNA合成途徑〔9〕。

1.2miRNA的再循環一般認為，miRNA半衰期長，是一種高度穩定的分子〔10〕。核酸外切酶在miRNA降解和再循環中可能發揮重要作用。研究表明，在動物體內，核酸外切酶(XRN)2可調控miRNA的衰退〔11〕。最近的研究證實，對于不同的miRNA和不同的類型細胞，miRNA的再循環差異很大，對神經元來說，其miRNA具有快速衰退的特征〔12〕。miRNA再循環可能有助于解釋其調節大量的翻譯的能力〔13〕。成熟的miRNA通過結合到Ago從而受到保護，而mRNA靶序列的存在被認為是在防止miRNA從RISC復合物釋放以及隨后降解的重要保護因素。因此，當mRNA靶序列不存在時，miRNA可被特異性釋放，使RISC可結合新的miRNA。

1.3miRNA的作用機制目前認為，miRNAs通過抑制mRNA翻譯或降解mRNA來調節基因表達。一旦摻入到RISC后，成熟miRNA通常在3'UTR區，通過堿基配對與靶mRNA轉錄識別。miRNA的2～6個核苷酸是目標識別的關鍵。miRNA及其靶mRNA序列之間互補的程度影響下游調控機制，精確的匹配可導致降解，而錯配將導致翻譯抑制。關于翻譯抑制的確切機制仍不清楚，目前有一些相關的假說模型，包括抑制翻譯起始、促進靶mRNA脫腺苷化、將miRNA及其靶點封存到P小體或應激顆粒或翻譯后RISC介導的蛋白降解〔14〕。miRNA與靶點相互作用可使蛋白水平降低1/2〔15〕。雖然miRNA被認為主要是負性調控基因表達，但在細胞應激等情況下miRNA也可以激活其作用靶點。

2與AD相關的miRNA

AD是一種復雜的神經退行性疾病，是老年癡呆癥的的最常見形式〔16〕。它起病隱匿，表現為緩慢的，漸進性的，并且不可逆的認知和記憶功能喪失，由于神經元和突觸的破壞，最終將導致癡呆和死亡。AD的主要病理特征包括淀粉樣蛋白-β(Aβ)沉積形成的老年斑、神經纖維纏結及膽堿能神經元及其突觸的喪失。關于AD的發病機制中，以Aβ級聯學說占主導地位。Aβ主要是一種40～42個 氨基酸片段，由其淀粉樣前體蛋白(APP)經APPβ位點裂解酶(BACE1)和γ-分泌酶依次裂解后生成。除了Aβ級聯學說外，還包括基因突變學說、膽堿能學說、免疫與炎癥學說和氧化應激學說等。

miRNA在神經系統中表達十分豐富，在軸突生長，樹突棘形成，神經元分化和突觸可塑性等過程中發揮關鍵調節作用。最近的研究表明，miRNAs網絡的改變將影響疾病的進程。AD患者腦組織中存在miRNA失調〔17〕。這些疾病相關miRNA的變化主要位于灰質區〔18〕。目前，已發現多種miRNA與AD關鍵基因調控變化有關，包括miR-106、miR-107、miR-132、miR-146、miR-153、miR-29和miR-9等。

2.1miR-106APP是miRNA調控的靶點之一。miR-106a和miR-106b可直接和APP mRNA結合，它們在AD患者前顳葉皮層表達下調〔19〕。有趣的是，miR-106能夠調節ATP-結合轉運體A1(ABCA1)，一種與ApoE脂化和生產Aβ的脂質轉運體，這表明miR-106的可以不止通過一條途徑影響Aβ的生成〔20〕。

2.2miR-107在AD的早期階段，顳葉皮層miR-107下調，并與BACE1上調有關，這可能影響Aβ的產生〔21〕。而miR-107的減少將進一步伴隨著神經炎斑塊密度的升高〔22〕。有趣的是，miR-107和miR-124a除了BACE1之外還能調節APP代謝的其他方面，從而表明單一miRNA可影響同一條通路上多個靶點的能力，并可產生累加效應的潛力。MiR-107可直接靶向加工APP的另一個分泌酶整合素和金屬蛋白酶10(ADAM10)，miR-124a通過直接靶向聚嘧啶結合蛋白1(PTBP1)參與APP mRNA選擇性剪接。

2.3miR-132研究表明，AD患者中miR-132表達異常。miR-132可介導Akt生存信號通路、抗炎通路和乙酰膽堿代謝〔23〕。在細胞培養模型，下調miR-132的水平可導致神經元死亡〔24〕，并且AD和亨廷頓病(HD)的患者組織中miR-132的表達減少〔25〕。

2.4miR-146miR-146a是AD與炎癥有關的一種miRNA，它可以調控先天免疫。在受AD病理影響的大腦區域，包括海馬和顳葉皮層，miR-146a表達上調；而在未受影響的區域miR-146a水平保持不變〔26〕。研究表明，miR-146a的作用靶點包括補體因子(CF)H，白細胞介素(IL)-1受體相關激酶1(IRAK1)和腫瘤壞死因子受體相關因子(TRAF)6，這些都與AD失調的先天免疫和炎癥通路有關〔27〕。miR-146a還可作用于跨膜四旋(TSPAN)12，TSPAN12是ADAM10的關鍵調節因子，因此miR-146a可能會影響Aβ的代謝〔28〕。這些發現進一步證明miRNA能夠影響多種通路并介導發病機制之間的串話。

2.5miR-153在APPswe/PSΔE9雙突變小鼠模型疾病的早期和晚期miR-153水平顯著下降。與缺少新皮層神經元纖維纏結的標本相比(對照和Braak Ⅰ/Ⅱ期標本)，尸檢后發現有新皮層神經元纖維纏結(Braak Ⅲ～Ⅳ期)的大腦標本中miR-153的水平明顯降低。miR-153可影響APP和β淀粉樣蛋白前體樣蛋白(APLP)2的mRNA轉錄〔29〕。此外，在人額葉皮層，miR-153和APP在蛋白水平發生逆向共調控〔30〕。因此，miR-153可在轉錄后水平調控APP/APLP2的表達，但這種潛在的相互作用需要進一步的驗證。

2.6miR-29miR-29家族可與BACE1 mRNA靶向結合，在散發AD患者中與BACE1的表達呈負相關。這種相關具有AD特異性，并在HEK293和SH-SY5Y細胞培養模型中得到驗證。除了調節BACE1，在老年大腦中miR-29a/b升高，并可調控小膠質細胞活化〔31〕。miR-29簇已在散發性和家族性患者中確定序列，并且發現與AD密切相關的簇中存在變異〔32〕。然而，這一發現需要在大樣本中進一步驗證，并深入闡明這些變異的具體作用。

2.7miR-9miR-9是一種高度保守的大腦富集的miRNA，也是迄今為止AD中最常見的失調miRNA，miR-9可能存在上調或下調兩種可能〔16〕。向體外原代培養神經元中添加Aβ可導致miR-9快速下降，表明miR-9下調可能與斑塊形成相關〔33〕。miR-9的作用靶點包括神經原纖維纏結中的一種蛋白質神經絲重鏈(NFH)和去乙酰化酶SIRT1，SIRT1與tau蛋白相互作用，并增加過磷酸化tau蛋白的積累〔34〕。其他三個抑制SIRT1的miRNAs，即miR-181c，miR-34，和miR-132，在AD大腦顯示一致的表達改變〔35〕。此外，miR-132有幾個與AD發病機制直接相關的靶點，包括張力蛋白同源物(PTEN)，叉頭蛋白O3A(FOXO)3A，和E1A結合蛋白P300，它們在神經細胞凋亡和乙酰膽堿酯酶(AChE)中都發揮重要作用。抑制AChE與膽堿能抗炎通路有關，是目前治療AD的常規藥物〔36〕。

2.8miR-34miR-34作為AD的另一個指標，他在體內有三種存在方式miR-34a，miR-34b。miR-34c，其中miR-34a，miR-34c被證實跟AD關系最密切。miR-34c在AD患者外周單核細胞和血漿中都有明顯的升高，與同年齡的正常組對照。并指出miR-34c通過抑制參與細胞的存活和氧化防御途徑的幾個選定的基因的表達，如Bcl2，SIRT1等，實現神經細胞的凋亡進而導致AD的發生發展〔37〕。

3miRNA治療AD的臨床應用

目前已有多個miRNA治療其他疾病的臨床試驗，如癌癥和慢性丙型肝炎病毒感染〔38〕。并且預期在未來幾年將有更多類似的臨床試驗及應用產生。miRNA的治療應用主要通過兩個策略：利用miRNA模擬物進行RNA干擾(RNAi)和通過miRNA拮抗劑抑制miRNA。已有大量的研究表明，應用RNAi技術靶向疾病相關基因，如BACE1和APP，在動物模型中表現出有益的作用〔39〕。但RNAi技術和傳統的藥物開發一樣面臨著同樣的挑戰，包括藥代動力學、靶向特異性、療效和毒性等〔37〕。而miRNA可以模仿自然發生的RNAi機制，因此可能毒性較低，并有證據表明治療神經退行性疾病時，與其他的短發夾RNA(shRNA)相比，miRNA免疫激活明顯降低。

miRNA作為治療劑的一個優點是它可以影響多個靶基因和通路。然而，這也可能是不利的，因為這可能導致脫靶效應。每個miRNA可以靶向幾百個mRNA,因此，了解miRNA與內源性RNA之間不期望的相互作用是顯得十分重要。另外一個值得考慮的是，人工合成的miRNA可能抑制體內生物合成機制，從而削弱內源性miRNA的作用。因此，非經典合成途徑的mirtron人工合成物有望成為未來miRNA治療理想來源。

4結論

由于AD的發病機制涉及多條途徑，目前臨床上尚無根治AD的有效藥物，只能對癥治療，無法緩解AD的病理進程。miRNA通過作用多個靶點和途徑，顯然將成為AD治療的一個極具前景的有效策略。

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〔2015-01-22修回〕

(編輯李相軍)

通訊作者：國海東(1981-)，男，博士，副研究員，碩士生導師，主要從事中醫藥防治心腦血管疾病研究。

基金項目：國家自然科學基金資助課題(81102670，31400838，81373754)

中圖分類號〔〕R741.02〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)21-6271-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.21.129