表沒食子兒茶素沒食子酸酯對2型糖尿病大鼠主動脈Ⅰ、Ⅳ型膠原及纖維連接蛋白表達的影響

侯改霞　趙功炎　習(xí)雪峰　肖國強

(河南大學(xué)體育學(xué)院，河南　開封　475001)

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表沒食子兒茶素沒食子酸酯對2型糖尿病大鼠主動脈Ⅰ、Ⅳ型膠原及纖維連接蛋白表達的影響

侯改霞趙功炎習(xí)雪峰肖國強1

(河南大學(xué)體育學(xué)院，河南開封475001)

〔摘要〕目的探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對2型糖尿病大鼠主動脈Ⅰ、Ⅳ型膠原(Col Ⅰ、Col Ⅳ)、纖維連接蛋白(FN)表達的影響及可能機制。方法通過高脂喂養(yǎng)加腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ)構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型。雄性SD大鼠分為正常對照組8只，模型組、EGCG低、中、高劑量組，每組10只。EGCG給藥組大鼠每周灌胃7 d。實驗結(jié)束后檢測大鼠血液血糖(GLU)、糖化血紅蛋白(GHb)、糖化血清蛋白(GSP)和主動脈超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、Col Ⅰ、Col Ⅳ、FN水平的變化。結(jié)果與正常對照組相比，糖尿病模型組的血液GLU、GHb、GSP水平和主動脈氧化應(yīng)激水平及主動脈Col Ⅰ、Col Ⅳ、FN表達均顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，EGCG中、高劑量組血液GLU、GHb、GSP水平和主動脈氧化應(yīng)激水平及主動脈Col Ⅰ表達均顯著降低(P<0.05)，EGCG高劑量組主動脈Col Ⅳ、FN表達顯著降低(P<0.05)。結(jié)論EGCG對2型糖尿病大鼠主動脈膠原合成異常增加具有明顯的改善作用，機制可能與EGCG的降血糖、抗氧化及降低氧化應(yīng)激下游與膠原代謝相關(guān)的信號通路效應(yīng)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕2型糖尿病；表沒食子兒茶素沒食子酸酯；主動脈；膠原代謝

1華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院

第一作者：侯改霞(1978-)，女，副教授，博士，主要從事運動、藥物與慢性病防治研究。

糖尿病大血管病變的特點是血管平滑肌細胞和膠原纖維隨著病程進行性增加，血管壁膠原纖維增加可導(dǎo)致血管硬度增加，表現(xiàn)為血管收縮、舒張功能障礙〔1〕，是導(dǎo)致糖尿病心血管疾病致死致殘的重要原因之一。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是兒茶素中研究最多的生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌、防輻射和調(diào)節(jié)糖脂代謝等多種生物學(xué)活性，對肥胖、糖尿病、癌癥、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)等疾病具有改善作用。已有研究表明EGCG可以降低糖尿病大鼠腎臟膠原異常增生，可有效改善糖尿病大鼠腎臟纖維化〔2〕。但EGCG對糖尿病動物主動脈膠原代謝影響的研究卻很少見。本文分析EGCG對糖尿病大鼠主動脈Ⅰ、Ⅳ型膠原(Col Ⅰ、Col Ⅳ)、纖維連接蛋白(FN)代謝的影響及其作用機制。

1材料與方法

1.1動物造模與分組雄性SD大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機分成：正常對照組(8只)和高脂飲食組(43只)，正常對照組繼續(xù)飼喂普通飼料，高脂飲食組改為高脂飼料喂養(yǎng)。飼喂6 w后，高脂飲食組大鼠過夜空腹12 h，腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ，30 mg/kg)。注射72 h后檢測大鼠隨機血糖濃度，隨機血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠暫時成模標準。剔除血糖不達標大鼠。1 w后復(fù)查暫時成模大鼠，隨機血糖仍≥16.7 mmol/L為建模成功，剔除不達標大鼠。共有40只大鼠造模成功。將造模成功后大鼠分為模型組、EGCG低、中、高劑量組，每組10只。

1.2主要試劑STZ購自Sigma公司，Col Ⅰ、Col Ⅳ、FN一抗、二抗和DAB顯色試劑購自北京博奧森生物科技有限公司，血糖(GLU)、糖化血紅蛋白(GHb)、糖化血清蛋白(GSP)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量檢測試劑盒購自南京建成生物研究所。

1.3EGCG灌胃處理EGCG溶于雙蒸水中制成(12 mg/ml)懸濁液。EGCG低(25 mg·kg-1·d-1)、中(50 mg·kg-1·d-1)、高(100 mg·kg-1·d-1)劑量組大鼠分別采用灌胃給藥方式，給藥組大鼠每周灌胃7 d，其他組大鼠灌胃雙蒸水，共12 w。

1.4動物取材和指標檢測給藥第12周末，各組大鼠過夜禁食12 h后，將大鼠稱重后腹腔麻醉，剖腹，從腹主動脈取血，一部分全血用于GHb檢測，其余全血3 000 r/min離心20 min，取血清置于-80℃冰箱保存檢測GLU、GSP。取胸主動脈置于4%多聚甲醛中固定以備免疫組化檢測，另取腹主動脈置于 -80℃冰箱保存以做MDA、SOD含量檢測。

1.4.1血液GLU、GHb、GSP水平檢測GLU測試采用磷鉬酸法，GHb采用比色法，GSP采用果糖胺法。操作檢測流程嚴格按試劑盒說明書進行。

1.4.2主動脈MDA含量和SOD活性檢測MDA采用硫代巴比妥酸法，SOD采用分光光度法，操作檢測流程嚴格按試劑盒說明書進行。

1.4.3主動脈Col Ⅰ、Col Ⅳ和FN免疫組化檢測常規(guī)乙醇梯度脫水，石蠟包埋切片，片厚4 μm，SABC法免疫組化染色，DAB顯色，中性樹脂封片。陽性部位顯色為棕黃色，每張切片隨機選出5個視野，在400倍光鏡視野下獲取圖像，采用Image-Pro Plus Version 6.0圖像分析系統(tǒng)分析，得出每個視野的平均光密度值(IOD/area)。

2結(jié)果

2.1EGCG對糖尿病大鼠血液GLU、GHb和GSP的影響與正常對照組相比，模型組、EGCG低、中、高劑量組血液GLU、GHb、GSP水平均顯著升高(P<0.01)；EGCG中、高劑量組血液GLU、GHb、GSP水平均顯著低于模型組(P<0.05)。見表1。

2.2EGCG對糖尿病大鼠主動脈MDA含量和SOD活性的影響與正常對照組相比，模型組、EGCG低、中、高劑量組主動脈MDA含量均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，SOD活性顯著降低(P<0.05)；EGCG中、高劑量組主動脈MDA含量均顯著低于模型組(P<0.05)，SOD活性顯著高于模型組(P<0.01)。見表2。

2.3EGCG對糖尿病大鼠主動脈Col Ⅰ、Col Ⅳ和FN表達的影響與正常對照組相比，模型組主動脈Col Ⅰ、Col Ⅳ和FN表達均顯著升高(P<0.01)；EGCG中、高劑量組主動脈Col Ⅰ表達雖顯著低于模型組(P<0.05)，但仍高于正常對照組(P<0.05)；EGCG高劑量組主動脈Col Ⅳ、FN表達均顯著低于模型組(P<0.05)。見表2，圖1。

表1　EGCG對糖尿病大鼠血液GLU、GHb和

與正常對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

表2　EGCG對糖尿病大鼠主動脈MDA含量、SOD活性、Col Ⅰ、Col Ⅳ和FN表達的影響

與正常對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

圖1　EGCG對2型糖尿病大鼠主動脈Col Ⅰ、Col Ⅳ和FN表達的影響(DAB，×400)

3討論

本實驗結(jié)果表明，糖尿病模型組大鼠空腹GLU、GHb和GSP均明顯升高。GHb是血液中血紅蛋白與糖類經(jīng)過緩慢、連續(xù)的非酶促反應(yīng)生成的產(chǎn)物，合成速率與紅細胞所處環(huán)境中的糖濃度成正比，GHb能反映測定點之前1～2個月甚至更長時間內(nèi)的平均血糖水平。GSP是一類類似果糖胺的物質(zhì)，是血漿中蛋白質(zhì)與葡萄糖非酶糖化過程中形成的一種高分子酮胺結(jié)構(gòu)，其濃度與血糖水平呈正相關(guān)，并保持相對穩(wěn)定，GSP反映的是測定前1～3 w內(nèi)血糖的平均水平。因此GHb和GSP分別從長期和短期反映了機體血糖濃度變化，是臨床糖尿病病人診斷和評估血糖水平的良好指標〔3〕。EGCG可顯著降低2型糖尿病大鼠血液GLU、GHb和GSP水平，且以EGCG高劑量組的效果最好，提示EGCG可長期穩(wěn)定的改善2型糖尿病大鼠糖代謝紊亂的現(xiàn)象，可能機制：① α-葡萄糖苷酶是小腸內(nèi)單糖吸收入血的關(guān)鍵酶。EGCG具有α-葡萄糖苷酶抑制劑的作用，可降低餐后血糖的持續(xù)升高，發(fā)揮血糖調(diào)節(jié)作用〔4〕。② EGCG是胰島素敏感因子〔5〕，可增加胰島素敏感性〔6～8〕，改善胰島素抵抗和糖代謝障礙，增加體內(nèi)葡萄糖的吸收和代謝。③ EGCG通過其高效的抗氧化活性，有效地清除自由基，改善體內(nèi)血糖升高引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少氧化應(yīng)激對胰腺β細胞的損傷，從而避免了胰島素分泌功能障礙而導(dǎo)致的血糖進一步升高〔9，10〕。④ 糖異生增強是糖尿病患者空腹血糖升高的主要原因之一。葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)是糖異生過度活化的關(guān)鍵酶，肝細胞核因子4α(HNF4α)是PEPCK和G6Pase關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，EGCG可通過下調(diào)肝臟〔11〕、腸道〔12〕HNF4α的表達而降低PEPCK和G6Pase的表達，抑制肝臟和腸道糖異生作用的過度活化。

葡萄糖自氧化、線粒體產(chǎn)生的活性氧(ROS)、非酶糖基化和多元醇通路是糖尿病機體內(nèi)ROS的主要來源。同時高血糖還可使糖尿病機體組織內(nèi)抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶基因表達下調(diào)，ROS清除減少〔13〕。動物和人體實驗均證實高血糖所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激水平上升可導(dǎo)致胰島素抵抗、抑制胰島素分泌，進而誘導(dǎo)β細胞凋亡，并進一步升高機體血糖水平，是糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要原因之一〔14，15〕。

本實驗表明，2型糖尿病大鼠主動脈氧化應(yīng)激水平顯著升高，而EGCG中劑量組和高劑量組對2型糖尿病大鼠主動脈氧化應(yīng)激水平均有降低作用，尤其以EGCG高劑量組的效果最好，這可能與EGCG的降血糖作用有密切關(guān)系。但EGCG對2型糖尿病大鼠主動脈氧化應(yīng)激水平降低作用的另一個重要原因是EGCG的強抗氧化作用。EGCG分子結(jié)構(gòu)上的B環(huán)和D環(huán)上具有多個抗氧化作用的酚羥基結(jié)構(gòu)，因此具有很強的抗氧化作用〔16〕。但EGCG抗氧化作用的詳細機制尚不完全明確，推測與其清除自由基〔17〕、提高抗氧化酶活性〔18，19〕的作用有關(guān)。

糖尿病大血管病變是糖尿病患者心血管疾病的重要危險因素。由糖尿病所引起的血管壁膠原含量的增加與血管收縮、舒張功能障礙密切相關(guān)。

Col Ⅰ、Col Ⅳ和FN是主動脈壁細胞外間質(zhì)成分(ECM)的重要組成部分。本研究結(jié)果提示2型糖尿病大鼠主動脈壁膠原合成異常增加，而EGCG中劑量組和高劑量組對2型糖尿病大鼠主動脈膠原合成異常增加均具有改善作用，尤其以EGCG高劑量組的效果最好。分析原因可能與EGCG有效降低2型糖尿病大鼠血糖和主動脈氧化應(yīng)激水平有關(guān)。機體在高血糖狀態(tài)下，ROS產(chǎn)生增多，激活多條與ECM合成有關(guān)的信號通路，直接或間接促進致纖維化因子TGF-β1蛋白表達，促進ECM成分的合成〔20，21〕。2型糖尿病大鼠血糖和主動脈氧化應(yīng)激水平的下降，主動脈壁膠原合成異常增加得到顯著改善；ECM的降解主要與纖維蛋白溶酶原激活劑(PA)/PA抑制劑(PAI)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)/MMP抑制劑(TIMP)系統(tǒng)有關(guān)。有研究表明高血糖所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激水平增加可打亂糖尿病機體PA/PAI和MMP/TIMP的表達之間的協(xié)調(diào)關(guān)系，致使ECM降解減少〔22，23〕。2型糖尿病大鼠血糖和主動脈氧化應(yīng)激水平的下降，主動脈壁膠原降解能力得到顯著改善。

4參考文獻

1徐瑞生，姜宗來，張傳森，等.糖尿病大鼠主動脈的重建〔J〕.解剖學(xué)報，2000；31(1)：78-81.

2Yamabe N，Yokozawa T，Oya T，etal.Therapeutic potential of (-)-epigallocatechin 3-O-Gallate on renal damage in diabetic nephropathy model rats〔J〕.J Pharmacol Exp Ther，2006；319(1)：228-36.

3王婧茹，趙晶晶，葉春玲，等.番石榴葉總?cè)茖?型糖尿病大鼠的降血糖和血脂作用〔J〕.中國病理生理雜志，2012；28(6)：1109-13.

4Zhong L，F(xiàn)urne JK，Levitt MD.An extract of black，green，and mulberry teas causes malabsorption of carbohydrate but not of triacylglycerol in healthy volunteers〔J〕.Am J Clin Nutr，2006；84(3)：551-5.

5Stote KS，Baer DJ.Tea consumption may improve biomarkers of insulin sensitivity and risk factors for diabetes〔J〕.J Nutr，2008；138(8)：1584S-8S.

6Venables MC，Hulston CJ，Cox HR，etal.Green tea extract ingestion，fat oxidation，and glucose tolerance in healthy humans〔J〕.Am J Clin Nutr，2008；87(3)：778-84.

7Kim JA.Mechanisms underlying beneficial health effects of tea catechins to improve insulin resistance and endothelial dysfunction〔J〕.Endocr Metab Immu Disord Drug Targets，2008；8(2)：82-8.

8Potenza MA，Marasciulo FL，Tarquinio M，etal.EGCG，a green tea polyphenol，improves endothelial function and insulin sensitivity，reduces blood pressure，and protects against myocardial I/R injury in SHR〔J〕.Am J Physiol Endocrinol Metab，2007；292(5)：E1378-87.

9Moyers SB，Kumar NB.Green tea polyphenols and cancer chemoprevention：multiple mechanisms and end points for phase Ⅱ trials〔J〕.Nutr Rev，2004；62(5)：204-11.

10Ceriello A，Motz E.Is oxidative stress the pathogenic mechanism underlying insulin resistance，diabetes，and cardiovascular disease? The common soil hypothesis revisited〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004；24(5)：816-23.

11Xie X，Liao H，Dang H，etal.Down-regulation of hepatic HNF4 alpha gene expression during hyperinsulinemia via SREBPs〔J〕.Mol Endocrinol，2009；23(4)：434-43.

12Yasui K，Tanabe H，Miyoshi N，etal.Effects of (-)-epigallocatechin-3-O-gallate on expression of gluconeogenesis-related genes in the mouse duodenum〔J〕.Biomed Res，2011；32(5)：313-20.

13Bhor VM，Raghuram N，Sivakami S.Oxidative damage and altered antioxidant enzyme activities in the small intestine of streptozotocin-induced diabetic rats〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2004；36(1)：89-97.

14Giacco F，Brownlee M.Oxidative stress and diabetic complications〔J〕.Circ Res，2010；107(9)：1058-70.

15Rains JL，Jain SK.Oxidative stress，insulin signaling，and diabetes〔J〕.Free Radic Biol Med，2011；50(5)：567-75.

16Kuzuhara T，Sei Y，Yamaguchi K，etal.DNA and RNA as new binding targets of green tea catechins〔J〕.J Biol Chem，2006；281(25)：17446-56.

17Yan J，Zhao Y，Suo S，etal.Green tea catechins ameliorate adipose insulin resistance by improving oxidative stress〔J〕.Free Radic Biol Med，2012；52(9)：1648-57.

18Roghani M，Baluchnejadmojarad T.Hypoglycemic and hypolipidemic effect and antioxidant activity of chronic epigallocatechin-gallate in streptozotocin-diabetic rats〔J〕.Pathophysiology，2010；17(1)：55-9.

19Roghani M，Baluchnejadmojarad T.Chronic epigallocatechin-gallate improves aortic reactivity of diabetic rats：underlying mechanisms〔J〕.Vasc Pharmacol，2009；51(2-3)：84-9.

20Wu J，Mei C，Vlassara H，etal.Oxidative stress-induced JNK activation contributes to proinflammatory phenotype of aging diabetic mesangial cells〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2009；297(6)：1622-31.

21Jiang Z，Seo JY，Ha H，etal.Reactive oxygen species mediate TGF-beta1-induced plasminogen activator inhibitor-1 upregulation in mesangial cells〔J〕.Biochem Biophys Res Comm，2003；309(4)：961-6.

22Lee EA，Seo JY，Jiang Z，etal.Reactive oxygen species mediate high glucose-induced plasminogen activator inhibitor-1 up-regulation in mesangial cells and in diabetic kidney〔J〕.Kidney Int，2005；67(5)：1762-71.

23Thrailkill KM，Clay Bunn R，F(xiàn)owlkes JL.Matrix metalloproteinases：their potential role in the pathogenesis of diabetic nephropathy〔J〕.Endocrine，2009；35(1)：1-10.

〔2014-09-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

通訊作者：習(xí)雪峰(1978-)，男，博士，講師，主要從事運動、藥物與慢性病防治研究。

基金項目：河南省科技廳2011年科技發(fā)展計劃項目(No.112102310576)

〔中圖分類號〕R587

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6330-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.005