cGKⅠ對胃癌細胞的抑制作用及其機制

趙　凱

(江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇　金壇　213200)

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cGKⅠ對胃癌細胞的抑制作用及其機制

趙凱

(江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇金壇213200)

〔摘要〕目的探討cGMP依賴性蛋白激酶(cGK)Ⅰ對胃癌細胞的抑制作用及其機制。方法構(gòu)建過表達cGK Ⅰ慢病毒，感染胃癌細胞株(AGS)獲得過表達cGK Ⅰ細胞系，通過四甲基偶氮唑藍比色法(MTT)測定過表達cGK對AGS細胞活力的影響，Western印跡檢測原癌基因p53，抑癌基因C-myc，細胞凋亡相關(guān)基因半胱氨酸蛋白酶(caspas)3以及遷襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、MMP-9蛋白的表達變化。結(jié)果cGKⅠ腺病毒載體感染的AGS細胞，細胞活性顯著下降。p53抑癌基因和C-myc原癌基因并沒有顯著變化，細胞遷移相關(guān)蛋白MMP-2、7、9均顯著下降，凋亡蛋白caspase3顯著上升。結(jié)論cGKⅠ對AGS細胞增殖有抑制作用。cGKⅠ誘導(dǎo)的細胞遷移能力的下降和凋亡的上升與抑癌基因和原癌基因無關(guān)，或者在AGS細胞中存在p53和C-myc原癌基因突變。

〔關(guān)鍵詞〕cGKⅠ；胃癌細胞

第一作者：趙凱(1974-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事消化內(nèi)鏡及消化道腫瘤的診治研究。

最近研究發(fā)現(xiàn)cGMP依賴性蛋白激酶(cGK)具有抗腫瘤作用，但其抗腫瘤的機制尚未完全闡明〔1〕。可能的機制主要有抑制營養(yǎng)性激素及生長因子的分泌、誘導(dǎo)凋亡、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答抑制腫瘤血管形成等〔2〕。但也有研究發(fā)現(xiàn)cGKⅠ在某些腫瘤組織中低表達〔3〕。本研究旨在初步闡明cGKⅠ在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其可能的機制。

1材料與方法

1.1實驗材料AGS細胞由上海生物研究所提供(cellbank)。兔抗人蛋白激酶cGKⅠ多克隆抗體購于SANTA CRUZ，批號為SC-25429；多克隆抗體基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2(H-76)、MMP-7(FL-267)、MMP-9 (H-129)、p53(FL-393)、C-myc、半胱氨酸蛋白酶(caspase)3均購于SANTA CRUZ公司，批號分別為sc-10736、sc-30071、 sc-10737、sc-6243、sc-789、sc-98785；腺病毒包裝試劑盒購于invitrogen公司，pAd/CMV/V5-DESTTMGateway?Vector Kit，批號為V493-20。

1.2實驗方法

1.2.1人cGKⅠ腺病毒表達載體的構(gòu)建上游引物：5'-CGCGGATCCAGTCGGCTACTATGGCGC-3',酶切位點BamH1，下游引物：5'-ATCAGGCCGCGAAAGTCCTGTTATC-3'，酶切位點Ecor1。

從人肺動脈組織中提取總RNA，行RT-PCR。產(chǎn)物進行定量后，取20 μg行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳證實PCR產(chǎn)物后，酶切膠回收目的基因片段，多聚腺苷加尾(A-Tailing)反應(yīng)后與載體pGEM-T連接，對重組質(zhì)粒pGEM-T-cGKⅠ進行PCR及酶切鑒定，并測序分析。純化酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶連接cGKⅠ及線性化的pAd-Track-CMV，轉(zhuǎn)化Dpα感受態(tài)細菌，篩選轉(zhuǎn)化的菌落行酶切鑒定。酶切重組腺病毒質(zhì)粒pAd-CMV-cGKⅠ，暴露其反轉(zhuǎn)末端重復(fù)序列(ITR)，用Lipofectamine TM 2000將線性化的pAd-CMV-cGKⅠ轉(zhuǎn)染至Ad293A細胞中，當(dāng)90%以上細胞出現(xiàn)病理征時收集細胞，反復(fù)快速凍融4次(-20℃和37℃、震蕩15 s)使細胞破裂釋放出病毒，然后將含有大量擴增的重組腺病毒載體的上清液轉(zhuǎn)移至新Eppendorf管中。

1.2.2四甲基偶氮唑藍比色法(MTT)分析將AGS細胞接種于96孔板中，每孔加細胞懸液30 μl(4.8×104個細胞)，待細胞生長至90%匯合時候，換10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。按實驗分組處理好細胞后，吸棄各孔培養(yǎng)液，每孔加入100 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育3～4 h，加120 μl二甲基亞砜(DMSO)震蕩混合15 min。用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測波長570 nm處的吸光度值(OD值)。

1.2.3Western印跡將細胞密度為80%的cGKⅠ腺病毒載體轉(zhuǎn)染的AGS細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗1次，裂解液裂解細胞并提取細胞總蛋白，行電泳分離，轉(zhuǎn)膜過夜后，室溫封閉3 h。加入Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗3次，10 min/次。用TBST按1∶100稀釋多克隆抗體MMP-2、MMP-7、MMP-9、C-myc、p53，室溫孵育。TBST洗膜3次，10 min/次。加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)，室溫孵育。蛋白檢測采用增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)，進行化學(xué)發(fā)光掃描。

2結(jié)果

2.1成功構(gòu)建了cGKⅠ腺病毒表達載體擴增實驗顯示cGKⅠ蛋白表達穩(wěn)定、高效。BamH1和EcoR1雙酶切重組質(zhì)粒pAdTrack-CMV-cGKⅠ，得到約9.2 kb和2.2 kb的2個片段，分別代表穿梭載體pAd-Track-CMV和cGKⅠ基因片段，證明穿梭質(zhì)粒構(gòu)建成功。見圖1。

圖1　pAd-Track-CMV和cGKⅠ鑒定

同源重組獲得重組腺病毒質(zhì)粒pAd-CMV- cGKⅠ，線性化重組腺病毒質(zhì)粒pAd-CMV- cGKⅠ使用Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染293A細胞3 d后，在熒光顯微鏡下同一視野的熒光和可見光照片(CPE)上可見空斑形成，細胞變圓、腫脹、脫壁、胞核變大等病變出現(xiàn)。轉(zhuǎn)染效率為(90±5)%。pAd-CMV- cGKⅠ病毒的滴度為2×106pfu/ml。不同組梯度濃度MOI值的重組腺病毒轉(zhuǎn)染胃癌AGS細胞，免疫熒光均可測到75 kD的cGKⅠ蛋白，而空載腺病毒、陰性對照組無cGKⅠ蛋白表達，說明重組腺病毒能在胃癌AGS細胞中高效表達cGKⅠ。見圖2～圖4。

2.2Western印跡見圖5。細胞遷移相關(guān)蛋白MMP-2、7、9均顯著下降，凋亡蛋白caspase3顯著上升。但是，p53抑癌基因和C-myc原癌基因并沒有顯著變化，顯示cGK Ⅰ誘導(dǎo)的細胞遷移能力的下降和凋亡的上升與抑癌基因和原癌基因無關(guān)，或者在AGS細胞中存在p53和C-myc原癌基因突變。

圖2　熒光顯微鏡下同一視野的熒光和可見光照片

圖3　pAd-CMV- cGKⅠ滴度測定

圖4　胃癌AGS細胞中高效表達cGKⅠ

圖5　Western印跡分析

2.3MTT結(jié)果cGKⅠ編碼的腺病毒載體感染AGS細胞經(jīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)后,吸光度值顯著降低，細胞活性顯著下降，細胞出現(xiàn)明顯抑制現(xiàn)象。

3討論

惡性腫瘤是危害人類健康的殺手，其中胃癌是中國常見的癌癥死亡原因之一，根據(jù)GLOBOCAN 2008的統(tǒng)計，2008年全球胃癌新發(fā)病例98.9萬，中國為46.3萬；同期全球死于胃癌的病例共73.7萬，中國為35.2萬〔4〕。腫瘤的發(fā)生與細胞內(nèi)信號通路的激活密切相關(guān)。隨著對腫瘤分子水平認識的不斷深入，針對腫瘤細胞生長、凋亡、細胞周期、侵襲浸潤以及血管生成等分子靶點提出的分子靶向治療逐漸成為抗腫瘤藥物治療的重點和熱點。

關(guān)于cGKⅠ與腫瘤的關(guān)系，沒有明確的報道。最近已有越來越多的證據(jù)表明，cGKⅠ可能與細胞增殖和凋亡等活動以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。Fallahian等〔5〕的研究顯示在胸腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-468中使用cGKⅠ的特異激活劑和抑制劑控制它們的表達，發(fā)現(xiàn)cGKⅠβ能夠促進細胞的凋亡。Kwon等〔6〕發(fā)現(xiàn)cGK能夠在腫瘤細胞中抑制β-catenin蛋白的表達。這些實驗都顯示，cGKⅠ在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。盡管有些文獻也指出cGKⅠ可能促進卵巢癌細胞的SRC活性提高其抗凋亡能力〔7〕。但這也從另一方面說明了cGKⅠ的研究價值。

caspase- 3作為調(diào)控細胞增殖和凋亡調(diào)控的重要基因，參與多種因素誘導(dǎo)的生理及病理性細胞凋亡過程〔8〕。C-myc基因在細胞的增殖與分化過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用，C-myc基因表達的失調(diào)是多種細胞凋亡的主要誘因，與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)〔9，10〕。抑癌基因p53在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，其中p53基因突變和p53蛋白過表達已被大量實驗所證實，被認為可能成為指導(dǎo)胃癌綜合治療、判斷預(yù)后的有效指標(biāo)〔11〕。MMP具有強烈惡性組織特性及獨特的分解各種細胞外基質(zhì)能力，在腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移中起著重要的作用〔12〕。

本文認為cGK Ⅰ抑制胃癌細胞株AGS細胞活力，而cGK Ⅰ誘導(dǎo)的細胞遷移能力下降和凋亡上升與抑癌基因和原癌基因無關(guān)，或者在AGS細胞中存在p53和C-myc原癌基因突變。

4參考文獻

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〔2015-03-25修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

基金項目：江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)臨床科技發(fā)展基金項目(No.JLY20120080)

〔中圖分類號〕R73

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015)22-6456-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.22.067