張力刺激對經脈筋膜成纖維細胞整合素β1亞基影響的體外研究*

★　熊江艷　陳波*　劉峰,3　胡鐵漢　(.貴陽中醫學院第一附屬醫院　貴陽 55000；.貴陽中醫學院針灸推拿學院　貴陽 55005；3.九江學院附屬醫院急診科　江西 九江 33000)

*基金項目：國家自然科學基金項目(81160456)；貴州省科技基金項目(黔科合J字[2014]2030號)。

**第一作者：熊江艷(1982—)，女，碩士。研究方向：針灸推拿的基礎與護理運用。

?

張力刺激對經脈筋膜成纖維細胞整合素β1亞基影響的體外研究*

★熊江艷1**陳波2***劉峰2,3胡鐵漢2(1.貴陽中醫學院第一附屬醫院貴陽 550002；2.貴陽中醫學院針灸推拿學院貴陽 550025；3.九江學院附屬醫院急診科江西 九江 331000)

*基金項目：國家自然科學基金項目(81160456)；貴州省科技基金項目(黔科合J字[2014]2030號)。

**第一作者：熊江艷(1982—)，女，碩士。研究方向：針灸推拿的基礎與護理運用。

摘要：目的：探討體外張力刺激對來自經脈相關筋膜結締組織成纖維細胞的整合素β1亞基的影響，從實驗和理論的角度佐證針推基本機械力學感受的基本原理。方法：應用不同強度的張力對培養的經脈相關筋膜結締組織成纖維細胞施加單次和多次刺激，成纖維細胞整合素β1表達情況通過熒光顯微鏡技術和圖像分析技術進行觀測。結果：跟空白對照組相比，在不同的刺激強度因素和刺激次數情況下，經脈相關筋膜結締組織成纖維細胞整合素β1熒光密度表達均增高，有統計學意義(P=0.000<0.01)。結論：在張力刺激作用下，經脈相關筋膜結締組織成纖維細胞整合素β1表達量發生了改變，在微觀力學上可能揭示針推張力刺激在經脈組織細胞中信號感受的細胞生物學機制。

關鍵詞：張力刺激；經脈；筋膜；成纖維細胞；整合素β1

針灸推拿是臨床護理常用的治療手段之一，而針灸推拿操作過程中存在大量的生物力學現象[1]。筆者課題組前期的研究表明：經脈腧穴來源的筋膜結締組織成纖維細胞受壓力刺激作用后，胞膜上力感受器分子中幾種整合素(Integrins)亞基的表達分布和含量均發生變化，這證實了整合素確是經脈非神經組織細胞感受針推治療信息的重要物質基礎[2]。而經脈相關筋膜成纖維細胞如何感受張力刺激目前尚不清楚。因此，本課題一方面選擇張力為研究對象，另一方面載體的選擇上繼續選擇同經脈腧穴相關筋膜成纖維細胞，在研究載體上獨立施加不同強度的張力，觀察經脈相關筋膜結締組織成纖維細胞整合素β1表達變化情況，深入探討體外張力刺激對經脈相關筋膜結締組織成纖維細胞力學信號生物感傳通路的影響，為針推機械力刺激的細胞生物學作用原理提供實驗依據，現將研究結果報告如下。

1材料和方法

1.1主要試劑兔抗鼠整合素β1多克隆一抗(USA，Santa Cruz Crop；批號：SC-8978)、抗熒光淬滅封片液(江蘇，碧云天生物技術研究所；批號：P0126)、FITC標記的羊抗兔二抗(KPL；批號：N1230010)、標準型胎牛血清(FCS，Hyclone，100mL；批號：BUC175)、低糖DMEM培養基(Gibco，USA，500mL；批號：NUH0187)、Ⅰ型膠原酶(Sigma，USA，100mg；批號：TA0512)、胰蛋白酶(Gibco，USA，10g；批號：MA446)、新生小牛血清(批號：090428；100mL，哈里生物工程有限公司)、封閉用正常山羊血清原液(北京，中杉金橋；批號：111106)。

1.2主要實驗器材CO2恒溫培養箱(MCO-15AC型，SANYO，Japan)、熒光顯微鏡及組像系統(Olympus，1×71，Japan)、成都電子科技大學提供的四點彎曲力學加載裝置、HHWCu600型電熱恒溫水浴箱(上海醫療器械廠)、細胞培養瓶(美國Costar公司)。

1.3經脈相關筋膜結締組織成纖維細胞的原代、傳代培養將SD孕鼠(四川大學華西醫學院動物中心提供，動物證號：SCXK(111)2009-09，孕期14天)頸椎脫臼處死，用手術剪剪開腹腔，將子宮剪下，在超凈臺上，用眼科剪和鑷子，將子宮剪開，取出胎鼠，置于解剖顯微鏡下，取胎鼠背部正中線督脈及其附近皮膚及皮下組織，寬約4mm，用手術刀刮取皮下筋膜結締組織，置于培養皿中，加3mL0.1%Ⅰ型膠原酶,用眼科剪將組織剪成糊狀，置于水浴搖床中消化30min；按成纖維細胞常規體外實驗方法提取、培養和傳代擴增細胞量。

1.4經脈相關筋膜結締組織成纖維細胞張力加載實驗

1.4.1加力板準備將四點彎曲細胞應變片置于濃硫酸中，隔夜后用清水沖洗，然后三蒸水重復沖洗數遍，在75%乙醇中浸泡24h，去除油脂成分；在無菌、超凈環境下，經過紫外線照射殺菌，接種細胞。

1.4.2細胞種板操作步驟取第5-8代的經脈相關筋膜結締組織成纖維細胞，制細胞懸浮液，按細胞密度1×104/mL接種于四點彎曲細胞應變片上，1mL/片，2～4h后在培養皿中加入無血清的DMEM20mL持續培養24h，細胞同步化后，換20mL 10%FCS的DMEM。

1.4.3實驗設計與分組(1)分組：將細胞隨機分為空白對照組，低、中、高強度張力刺激組，單次加力組和多次加力組。(2)張力刺激組處理：將張力刺激組細胞置于四點彎曲力學加載裝置，然后移入100%濕度、5%CO2、37℃培養箱中，分別將四點彎曲力學加載裝置位移調節至0.5mm(1000μstrain，低強度張力刺激)、1mm(2000μstrain，中強度張力刺激)和1.5mm(3000μstrain，高強度張力刺激)，0.5Hz頻率單次加力，2h/次；多次加力時間間隔24h，取出細胞備檢時間為加力結束后再繼續培養2h。(3)空白對照組處理：將空白對照組置于100%濕度、5%CO2、37℃培養箱中正常培養，不作任何處理，取出備檢時間與各張力組一致。

1.5整合素β1表達檢測(免疫熒光技術)移棄培養基，PBS清洗5min/次，3次；加入40g/L的多聚甲醛2mL毫升，固定30min，PBS洗3次，5min/次；加0.5%TritonX-100置20min，PBS清洗3次，5min/次；避光加3%H2O2去離子水20min，PBS清洗3次，5min/次；加5%正常山羊血清封閉液30min；加1∶100兔抗鼠整合素β1多克隆一抗4℃過夜后，復溫30min，PBS避光清洗3次，5min/次；避光加1∶20FITC標記的羊抗兔二抗30min，PBS避光洗3次，5min/次；避光在載玻片上滴加一滴抗熒光淬滅封片液，血蓋片細胞面向下置于載玻片上封片避光送檢，熒光顯微鏡下采圖。然后，采用Image Pro Plus圖像定量分析軟件，掃描加力板上顯色成纖維細胞進行染色積分光密度定量測量。

圖1　空白對照組熒光密度(單次加力，×400)　　　　　圖2　低強度張力刺激組熒光密度(單次加力，×400)

注：析因方差分析表明,刺激強度因素MS=7.705，F=12773.860，P=0.000<0.01；刺激次數因素MS=0.259，F=429.876，P=0.000<0.01；刺激強度與刺激次數綜合因素MS=14.712，F=24389.833，P=0.000<0.01。

2結果

從圖1-8、表1可以看出：①單次刺激各組中以3000μstrain組的熒光密度最大，空白對照組的熒光密度最小；②多次刺激各組中熒光密度最大出現在2000μstrain組，熒光密度最小出現在3000μstrain組；③本次實驗熒光密度最大組是2000μstrain多次刺激組；④實驗組與空白對照組對比，不同的張力刺激強度因素與不同的刺激次數因素對經脈相關筋膜結締組織成纖維細胞整合素β1熒光密度表達增高有顯著統計差異(P=0.000)；⑤張力刺激次數和刺激強度兩因素累加對經脈相關筋膜結締組織成纖維細胞整合素β1熒光密度的提高有統計學意義(P=0.000)。

3討論

從毫針針刺力學理論分析[1]，當毫針刺入腧穴后，如捻轉達到一定幅度，在不直接接觸針體的鄰近區域，穴區組織細胞會受到纏繞針身的細胞基質傳導的、沿針體轉動切線方向的牽張力作用；行針是以擺動為主要操作的，針體對周邊組織也會產生與針體擺動方向相反的牽張力刺激。從推拿按摩手法的力學維向分類[3]，不同手法又可分為一維力型手法、二維力型手法、三維力型手法，因此，推拿按摩的力學刺激中張力作用也是重要的力學形式之一。

現代研究表明：筋膜結締組織是經絡腧穴的物質基礎[4]，除了神經生物學機制[5]，針灸推拿發揮治療作用還存在非神經生物學機制[6]。在非神經生物學機制中，整合素是力學信息生物轉換的重要力感受器分子之一——整合素是一個膜受體家族[7]，α、β兩條鏈以非共價鍵連接而成的異源雙體構成成員分子。α、β兩條鏈都具有胞內區、胞外區和跨膜區，β鏈膜內與細胞骨架相連，β鏈胞外區與胞外基質相連，似一座橋梁介導細胞內外信息的傳遞。由于組成亞基不同，整合素主要分為β1、β2、β3等3類，功能有所差異。其中，整合素β1亞基與整合素α1-8和αv亞基可分別組成整合素VLA-1-6、α7β1、α8β1及αvβ1(VNR)共12種整合素，在各種細胞中廣泛表達。當力學刺激作用于組織或細胞后，Integrins在細胞膜上銜接集聚，Integrin細胞外區域直接與ECM蛋白結合，而胞漿內的區域則與細胞內的細胞骨架(主要是微絲)和信號復合體結合，共同形成局部黏附，激活局部黏附激酶通道，引起細胞核內基因表達的變化[8]。Ingber[9-10]等發現扭力對細胞表面的作用，可以激發cAMP的信號級聯反應和后續基因表達，該過程被認為是由Integrinβ1的變形傳遞至微絲激發所致，因此，目前認為力的感傳方式中Integrins途徑是最主要的途徑之一。

本次研究顯示：經脈相關筋膜結締組織成纖維細胞整合素β1可以感受不同程度的張力刺激：單次刺激，在重度刺激強度下經脈相關筋膜結締組織成纖維細胞整合素β1表達量高；多次刺激，在中度刺激強度下經脈相關筋膜結締組織成纖維細胞整合素β1表達量高。這表明針灸推拿學的臨床意義可能是：張力是經絡腧穴的有效刺激手段，在采用針灸推拿進行臨床護理時，短時間周期或單次的治療，以能產生張力刺激較重手法為首選；長時間周期或多次治療，以能產生張力刺激較輕的手法為首選，它可使經穴組織細胞的感受能力保持在較高水平。但這需要在體研究的進一步驗證。

參考文獻

[1]陳波,江瑜,張小珊,等.機體非神經組織力學敏感細胞的研究與針推治療作用機理的新思考[J].貴陽中醫學院學報,2012,34(1):9-12.

[2]吳小鳳,王興桂,劉峰,等.基本機械力學刺激對腧穴筋膜成纖維細胞力感受器分子整合素α2、αv亞基表達影響研究[A].2012全國腧穴應用與研究暨針灸教育研討會論文集,2012：45-48.

[3]陳波,王興桂,李小玉,等.體外壓力刺激對大鼠“足三里”穴筋膜組織細胞合成釋放腫瘤壞死因子-α和干擾素-β影響的研究[J].時珍國醫國藥,2011,22(3):734-736.

[4]費倫,承煥生,蔡德亨,等.經絡物質基礎及其功能性特征的實驗探索和研究展望[J].科學通報,1998,43(6):658-672.

[5]郭義.實驗針灸學[M].北京:中國中醫藥出版社,2008:416.

[6]陳波,崔瑾,謝西梅,等.體外壓力刺激對大鼠“足三里”穴筋膜組織成纖維細胞合成釋放基質金屬蛋白酶1、基質金屬蛋白酶抑制劑1、前列腺素E2和胰島素樣生長因子1的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復,2010,15(15):2 756-2 759.

[7]Viola V, Wendy GT, David WC. Structural insights into the mechanical regulation of molecular recognition sites[J].Trends in Biotechnology,2001,19(10):416.

[8]Bloom S,Lockarcl VC,Bloom M.Intermediate filament-mediated stretch-induced changes in chromatin: a hypothesis for growth initiation in cardiacmyocyte [J].J Mol Cell Cardiol,1996,28(10):2 123-2 127.

[9]Ingber DE.Tensegrity:the architectural basis of cellular mechanotransduction[J].Annu Rev Physiol,1997,59(1):575-599.

[10]Alenghat FJ,Tsai KY,Goldmann WH, et al.Analysis of cell mechanics in single vinculin-deficient cells using a magnetic tweezer[J].Biochemical and Biophysical Research Communication,2000,277(1): 93-99.

收稿日期：(2015-07-08)編輯：萬崇毅

中圖分類號：R245.2

文獻標識碼：A

通信作者：***陳波(1974—)，男，博士，教授，碩士生導師。研究方向：針灸推拿的基礎與臨床運用。E-mail:chenbomed@163.com。