簡析病理學的常用技術原理及實施要點

趙振剛 呂 莉（吉林市人民醫院病理科，吉林 吉林 132001）

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簡析病理學的常用技術原理及實施要點

趙振剛 呂 莉
（吉林市人民醫院病理科，吉林 吉林 132001）

【摘要】病理學為一門活躍，但又古老的學科，在醫學領域、生物學領域，占據著重要的作用。其中在醫學教育中，病理學這是臨床檢驗以及疾病診斷的重要手段，在醫學中起著不可替代的作用。分析研究病理學常用技術原理，并分析其應用實施情況。

【關鍵詞】病理學；技術原理；實施要點

病理學為一門基礎性醫學課程，其主要涉及的內容為研究人體疾病發生原因、發病機制、發展規律、疾病機體中形態、功能代謝以及病變轉歸。一直以來，病理學被看作臨床醫學與基礎醫學之間的橋梁學科?？陀^分析病理學常用技術以及實施情況，對于之后臨床醫學診療水平的提高有重要作用。

1　人體以及組織與細胞病理學技術

1.1 基本觀察：主要借助放大鏡或單純靠肉眼、磅秤以及量尺等工具，細致剖檢人體標本病變的大小、顏色、質地、表面以及周圍組織器官，并進行統計測量、取材，若有必要可攝影留作檢查資料。觀察人體大體，是病理醫師的基本工作內容，也是正確診斷的第一步，為醫學生學習病理的主要方法。

1.2 觀察組織病理學：經肉眼已經確定的病變組織取材后，采用石蠟包埋或福爾馬林溶液固定制成切片后，在不同方法染色后經光學顯微鏡觀察，分析、綜合其病變特點，診斷病理。組織切片最常用的染色方法是蘇木素-伊紅染色。這一方法為研究以及診斷疾病最常用、最簡單的方法，若不能做出明確診斷，可輔助采用免疫組化、特殊染色以及其他觀察方法。

1.3 觀察細胞病理學：取樣病變處細胞，經涂片染色后進行診斷、觀察。一般來說，細胞的來源主要為女性生殖道、食管、口腔、鼻咽喉等病變部位處直接取脫落細胞，也可是自然的排泄物、體液、分泌物中的細胞。細胞學檢查不僅可用于患者，同時還可用于普查腫瘤。檢查設備簡單、操作方便，對患者造成的疼痛輕微，容易被患者所接受。但若需確診是否為惡性病變，需實施活檢確診。

2　免疫組織化學技術以及組織化學

2.1 免疫組化以及免疫細胞化學：免疫組化以及免疫細胞化學是是由傳統的組織化學以及免疫學結合而形成，是利用抗原體特殊性結合反應進行檢測的一種技術。免疫組化技術具有較高的特異性以及敏感性，同時還能改變形態學，與功能、代謝變化相結合，直接可在細胞涂片、組織切片或培養細胞爬片上，確定某些多肽類物質存在，并具有較高的精確性，可定量分析被檢測物質。

2.2 組織化學：一般可稱為特殊染色，通過應用某些可于細胞或組織的化學成分發生特異性結合的顯色試劑，定位顯示病變，且能保存原有組織形態，實現代謝與形態的結合。

3　電子顯微鏡技術

電子顯微鏡技術神經電子透鏡以及電子術合成的電子光學系統多極放大后，微小物體被放大成像，提高分辨率。其中透射電子顯微鏡為應用最早、最廣泛的一種電鏡。光學顯微鏡以及電子顯微鏡的基本原理相同，不同時電鏡的照明源為電子術，光鏡的照明源為可見光。因電鏡的分辨率較高，因此電鏡樣本的處理以及超薄切片涉及，要比光鏡技術更為復雜以及精細，但基本過程相同，包括組織取材、固定、浸透、包埋等。電鏡樣本制備不同于常規病理制備，它要求組織必須新鮮，選擇最具代表性的區域小塊取材；雙重組織固定；環氧樹脂包埋；重金屬鹽染色；半薄切片染色后組織定位實施切制超薄切片。

4　顯微切割技術

顯微切割技術為當前臨床新興的一門技術，它可從細胞涂片任意區域、或組織切片切割下幾十個、幾百個同類細胞。用顯微切割組織切片是采用石蠟包埋組織切片、細胞切片、冷凍切。其厚度為4～10 μm，且冷凍切片需經乙醇固定。另外，顯微切割的組織切片必須染色，便于進行單一細胞或目標細胞定位。染色方法不固定，也可采用免疫組化染色。常用的顯微切割方法為手術操作方法、激光捕獲顯微切割法。顯微切割術的特點是從構成復雜的組織中，獲得某一特定的單個細胞或同類細胞群，比較適用于腫瘤分子生物學研究。但該技術的不足在于操作難度大。

5　核酸原位雜交技術

原位雜交是核酸分子雜交一部分，將分子生物技術與組織化學相結合用于檢測以及定位核酸的技術。它是將已經標記好的核苷酸片段作為探針，經雜交直接在細胞涂片、培養細胞爬片或組織切片上定位以及檢測某一特定靶的RNA或DNA的存在。其生物化學基礎為堿基、復性、DNA變性互補配對結合，依據所選取的探針以及待檢測靶序列不同，有RNA-RNA雜交、DNA-RNA雜交、DNA-DNA雜交。

5.1 選擇并標記探針：適用于原位雜交的探針有單鏈cRNA探針、單鏈cDNA探針、雙鏈cDNA探針以及合成的寡核苷酸探針。一般探針標志物有非放射性、放射性之分，前者有生物素、地高辛、熒光素，盡管其敏感性不佳，但性能穩定、操作簡單方便、成本低，被越來越廣泛應用于臨床治療中，后者敏感性較高，但有放射性污染以及半衰期，耗時長所需費用高，因此應用受到限制。

5.2 原位雜交程序：所需的材料為冷凍組織切片、常規石蠟包埋組織切片、細胞涂片、培養細胞爬片等，主主要程度為雜交前準備、預準備、雜交、雜交后處理、雜交體檢測等。操作中應該注意：對RNARNA雜交、DNA-RNA雜交，需先采取RNA酶滅活處理；雜交溫度不能低于雜交體解鏈溫度25 ℃。

5.3 熒光原位雜交：可直接或間接實施熒光原位雜交，直接發是講熒光素直接標記到已知的DNA探針，檢測靶序列為DNA；間接法：非熒光標志物為已知DNA探針，并與一個熒光標記抗體橋連。

6　激光掃描共聚焦顯微技術

激光掃描聚焦顯微鏡（LSCM）為當前生物醫學圖像分析儀器研究中藥成果之一，是利用計算機圖像、激光掃描技術、光學顯微技術結合而形成的高技術設備，主要組成部位有計算機、顯微鏡、掃描頭以及激光器。共聚焦成像利用探測點以及照明點共軛特性，抑制同一聚焦平面上非測量點雜散熒光，其獲得的分辨率顯著高于顯微鏡。同時具有縱向分辨率以及深度識別能力，可清晰看到較厚生物樣本細節。

6.1 LSCM主要功能：細胞、組織光學切片，利用計算機以及圖像的處理系統對亞細胞結構、組織進行分層掃描，可稱為顯微CT或細胞CT；重建三維立體空間；長時間觀察活細胞；定量測定細胞內的酸堿度、細胞離子；熒光漂白恢復技術，利用高強度的脈沖式激光照射某一區域處，會該區域的熒光分子進行漂白；研究細胞間通訊。

6.2 LSCM樣本要求以及使用局限：LSCM中要求的樣本最好為培養細胞樣本，石蠟包埋切片則不適用于該技術。LSCM主要采用直接或間接的熒光原位雜交技術以及免疫熒光染色技術。其中的抗體的質量或熒光標記的探針會對實驗結果起到直接的影響作用。

7　原位多聚酶鏈式反應技術

原位多聚酶鏈式反應技術（PCR）為多聚酶鏈式反應技術，是在體外經酶促反應高效、快速擴張某一特定DNA序列，可將單一拷貝的待測核酸以指數形式增加，而達到常規檢測水平，不能實施組織定位。原位PCR技術是將原位雜交細胞與細胞學定位相結合，在細胞涂片、石蠟包埋組織切片或培養細胞上爬片上檢測，定位核酸［1-3］。

原位PCR技術可用于檢測以及定位低拷貝內源性基因，在完整細胞樣本上，可檢出單一拷貝DNA序列，可用于研究觀察基因重排、基因突變，還用于檢測以及定位外源性基因［4-6］。隨著當前現代生物技術的不斷進步發展。理論上講，PCR為一種完美的技術，其敏感性較高，具有基因細胞內定位功能，但該技術應用尚不完善。主要表現為特異性不高；技術操作復雜；需結合采用特殊設備，應用器械價格昂貴。

隨著自然科學的不斷進步發展，醫學逐漸形成多種分支，其共同目的在于從不同角度，采用不同方法研究患病機體的生命活動，病理學從形態學、病因學等、生物化學等方面進行研究分析，保證人們的生命健康。

參考文獻

［1］ 胡永波.分子病理學技術應用原理和適用范圍［J］.中國傷殘醫學，2013，21（10）:464-465.

［2］ 董建強，田玉旺.病理技術學科的規范化與質量控制［J］.診斷病理學雜志，2013，20（12）:737-739.

［3］ 王文勇，黃曉峰，閆慶國，等.新技術、新方法在病理學中的應用［J］.臨床與試驗病理學雜志，2012，28（8）:909-911.

［4］ 劉剛，趙德軍，白浪.失眠病因病理及非藥物治療［J］.中國療養醫學，2014，23（3）:282-282.

［5］ 段英飛，趙小軍，李曉鋒，等.病理信息系統在病理技術工作中的應用［J］.臨床與實驗病理學雜志，2014，30（3）:334-335.

［6］ 鄒萬忠.重視病理學的研究和應用［J］.北京大學學報:醫學版，2008，40（4）:341-342.

中圖分類號：R36

文獻標識碼：C

文章編號：1671-8194（2016）08-0298-02