抗PSMA膜外域單克隆抗體的制備及初步應用①

陶　嶸　倪振華　陽　圣　劉　沖　朱　敏　沈江帆　涂少華

(上海市中醫藥大學附屬普陀醫院，上海200062)

抗PSMA膜外域單克隆抗體的制備及初步應用①

陶嶸倪振華陽圣劉沖朱敏沈江帆涂少華②

(上海市中醫藥大學附屬普陀醫院，上海200062)

[摘要]目的：制備抗PSMA膜外域單克隆抗體。方法：應用生物信息技術預測PSMA膜外域多肽抗原片段，原核表達，免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤技術制備抗PSMA膜外域單克隆抗體，親和層析純化和Western blot及ELISA鑒定，并用于前列腺癌動物模型放射免疫顯像。結果：經軟件分析，獲得含310aa序列特異性強的膜外域抗原片段，免疫、融合后，經過ELISA篩選獲得到3株陽性雜交瘤細胞株(5E6、4A5和4D7)，亞型鑒定結果為5E6、4A5為IgG2a，4D7為IgG1，腹水型抗體效價均在1∶256 000以上；Western blot結果表明，所制備的單克隆抗體均可與PSMA膜外域抗原特異性結合，競爭抑制ELISA試驗顯示制備的單抗與重組抗原及標準抗原PSMA能競爭結合。動物模型放射免疫顯像結果進一步證實，制備的單克隆抗體在動物體內能與PSMA 膜外域抗原特異性結合，并使腫瘤顯像。結論：制備的抗PSMA膜外域單克隆抗體能特異性識別PSMA抗原，為前列腺癌的免疫診斷及免疫治療奠定了基礎。

[關鍵詞]前列腺特異性膜抗原(PSMA)；單克隆抗體；前列腺癌

前列腺特異性膜抗原(Prostate specific membrane antigen,PSMA)是前列腺上皮細胞膜的一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，共750個氨基酸殘基，由三個結構域組成，分別是含19個氨基酸的胞內域，含24個氨基酸的跨膜域和含707個氨基酸的胞外域，是一種比前列腺特異性抗原(PSA)更敏感、更特異的前列腺癌腫瘤標志物[1，2]。在前列腺癌，特別是非雄性激素依賴性前列腺癌及轉移灶中呈高表達，而在前列腺外正常組織僅少量表達，具有很高的組織特異性，因此成為前列腺癌靶向診斷及治療研究中一種比較理想的靶蛋白[3]。1987年，Horoszewicz等[4]首先將前列腺癌細胞株LNCaP的細胞膜成分分離出來，用其免疫小鼠篩選出一株單克隆抗體7E11-C5，該抗體與LNCaP前列腺癌細胞膜發生反應，是最早的抗PSMA單克隆抗體，隨后應用放射性核素標記抗PSMA單克隆抗體(7E11-C5.3)進行放射免疫顯像以早期發現轉移癌和復發癌，在前列腺癌的診斷、臨床分期、復發及監測方面顯示了良好的應用價值[5，6]，但存在一定的局限性：由于單克隆抗體(7E11.c5)結合位點在前列腺癌細胞的胞內氨基端，對于細胞膜完好的癌細胞，單克隆抗體不能進入與之結合，這嚴重影響了7E11.c5的使用效果，因此，制備針對PSMA胞外域的特異性單克隆抗體，有望：①克服抗體7E11.c5與PSMA抗原結合的局限性，提高前列腺癌免疫顯像的靈敏度；②除了能進行前列腺淋巴結等軟組織顯像外，還有望用于骨轉移顯像；③通過標記發射β射線的核素，還有望用于前列腺癌的放射免疫治療。本研究應用生物信息技術和原核表達技術預測并表達PSMA膜外域多肽抗原片段，用表達的多肽抗原，免疫BALB/c小鼠，通過雜交瘤技術制備抗PSMA膜外域單克隆抗體，并應用此抗體進行前列腺癌動物模型顯像，為前列腺癌靶向診斷及靶向治療奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株、實驗動物小鼠骨髓瘤細胞(Sp2/0)，由上海生物工程公司提供；6～8周齡雌性BALB/c小鼠，由上海第一人民醫院動物實驗中心提供。前列腺癌細胞株：PSMA陽性前列腺癌LNCaP細胞株和PSMA陰性前列腺癌細胞株PC3(中科院上海細胞生物研究所)；實驗動物：BALB/c-nu/nu雄性裸鼠(中國科學院上海藥物研究所，許可證號[SCXK(滬)2004-0002]，鼠齡4~6周，體重18~25 g。

1.1.2主要試劑RPMI1640培養液、胎牛血清購自Gibco公司；8-氮鳥嘌呤、HT、HAT、PEG、弗氏完進行全佐劑、弗氏不完全佐劑、PSMA標準抗原均購自Sigma公司；HRP-羊抗鼠IgG購自武漢三鷹生物技術有限公司;注射用MDP藥盒(北京欣科思達醫藥科技有限公司)、Na99TcmO4(上海原子科興藥業有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1PSMA膜外域多肽抗原的預測及表達載體的構建PSMA膜外域多肽抗原預測：根據NCBI GenBank中報道的PSMA(Gen Bank：AAA60209.1)一級結構信息[7]，采用ExPASy、Protean 和Blastn 等軟件對PSMA膜外域氨基酸序列進行親水性、抗原指數及同源性分析，篩選親水性好、抗原性強，同源性低的氨基酸序列為多肽抗原序列，確定PSMA 膜外域C端的310個氨基酸(aa440~750)為本次要表達的PSMA膜外域抗原片段，針對原核表達宿主，對預測的PSMA膜外區多肽基因序列進行偏愛密碼子優化設計后，由上海生物工程公司進行全基因合成，并插入到pET-32a載體上，插入位點為KpnⅠ和XhoⅠ。原核表達載體的構建：對目的基因和表達載體(pET-32a)分別進行KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切，膠回收酶切產物。將酶切后的目的片段和質粒室溫連接后轉化到DH5α菌株中。挑取轉化后平板上的單菌落于試管中37℃、220 r/min培養過夜，抽提質粒，KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，并將重組質粒送測序鑒定，測序正確的重組質粒，命名為pET-32a-r-ectodomain-PSMA。

1.2.2目的蛋白的表達與鑒定構建好的pET-32a r-ectodomain-PSMA表達載體轉化到表達菌株BL21(DE3)中，加入終濃度0.5 mmol/L的IPTG誘導蛋白表達，設定表達溫度為15℃、25℃、37℃，誘導時間分別為15℃過夜、25℃過夜、37℃ 5 h，誘導結束后終止表達，離心收集菌體，超聲破碎后進行SDS-PAGE電泳鑒定。然后使用鎳離子親和層析，對目的蛋白純化。

1.2.3單克隆抗體制備及純化將純化的目的蛋白免疫3只BALB/c小鼠。初次免疫使用重組抗原與弗氏完全佐劑等體積混合，背部多點注射免疫(50 μg/只)。后期免疫均用重組抗原與弗氏不完全佐劑等體積混合，腹腔沖擊免疫(50 μg/只)。每隔兩周免疫一次，免疫三次。在準備細胞融合前3 d小鼠腹腔再沖擊免疫一次(100 μg/只)。陽性克隆篩選：選取效價最高的小鼠脾細胞，按SP2/0細胞與脾細胞1∶10比例融合，采用間接ELISA法對融合細胞培養上清進行檢測，篩選陽性克隆株，方法如下：以重組表達的PSMA胞外域多肽抗原包板(50 μl/孔，5 μg/ml)4℃，過夜，用0.05% PBS-Tween 20洗二次，2% BSA每孔300 μl 37℃封閉45 min,再洗二次，每孔加100 μl稀釋1 000~5 000倍的培養上清液或腹水，37℃溫育1 h，洗5次，加入1∶400稀釋HRP-羊抗鼠IgG,37℃溫育1 h,洗5次，TBM溶液顯色，以2 mol/L硫酸50 μl終止反應，以酶聯檢測儀測定450 nm光密度OD450。單克隆抗體的大量制備及純化：將BALB/c小鼠預注射500 μl不完全佐劑，7 d后，每只小鼠注射約106陽性克隆細胞，每天觀察小鼠腹部變化，待小鼠腹部脹大，收集腹水，離心棄沉淀，先用飽和硫酸氨粗提，用pH7.4 PBS透析，再使用protein A/G-Plus Beads抗體純化柱(上海悅克生物科技)純化抗體。方法如下：待純化的腹水先用0.45 μm的濾膜過濾，調節pH值至7.5，然后過protein A 柱進行親和層析純化，洗脫液用0.1 mol/L甘氨酸緩沖液pH2.7，洗脫下來的純化抗體再用pH7.5 PBS透析過夜。

1.2.4單克隆抗體免疫球蛋白類別及亞型鑒定采用Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Bio-Rad)鑒定單克隆抗體的型及亞型，方法如下：首先，用TBS緩沖液將腹水或雜交瘤培養液1∶50 000稀釋，取稀釋抗體50 μl包板(8孔條)，其次，將辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA和IgM，每孔50 μl各加一條，室溫溫育1 h，洗板3次，每孔加75 μl TMB底物，室溫溫育10 min,每孔加75 μl終止液，于450 nm波長讀數。

1.2.5單克隆抗體效價測定采用間接ELISA法(方法同克隆篩選)測定單抗效價。

1.2.6單克隆抗體的Western blot鑒定將純化的PSMA抗原進行15% SDS-PAGE，轉膜后5%脫脂奶粉封閉過夜，以制備的抗PSMA膜外域單抗為一抗(1∶10 000)，HRP標記的羊抗鼠抗體為二抗(1∶300)，TMB底物顯色，出現條帶時終止反應。

1.2.7單克隆抗體的ELISA鑒定競爭抑制試驗：將純化的重組PSMA抗原用包被稀釋液稀釋后(終濃度4 μg/ml)包被酶標板，每孔100 μl，4℃孵育過夜，用洗滌液洗3次。每孔加入封閉液200 μl，37℃封閉1 h，用洗滌液洗3次。將標準抗原PSMA用稀釋液制備成64、32、16、8、4、2、0 μg/ml七種濃度，每種濃度加2孔，每孔加辣根過氧化物酶標記的抗PSMA單克隆抗體5E6 50 μl，37℃孵育40 min,用洗滌液洗5次，加入底物100 μl，避光顯色15 min,加終止液50 μl，用酶標儀(450 nm)測定各孔OD值，繪制抑制曲線。

1.2.8單克隆抗體的放射免疫顯像前列腺癌動物模型的建立：將PSMA陽性的LNCaP細胞株進行培養，取對數生長期的LNCaP細胞進行消化，制成單細胞懸液，調整細胞濃度接近于1×108個/ml，接種0.2 ml于BALB/c祼鼠的右側后背部皮下，待腫瘤生長至直徑約1 cm時，作為實驗鼠用于SPECT顯像；用PSMA陰性的PC3細胞建立的移植瘤作為對照。單克隆抗體的放射性標記：采用直接標記法[8]進行標記:在360 μg 5E6單克隆抗體中加入10 μl 2-巰基乙醇，搖勻，30℃放置30 min，即為還原抗體，用2 ml生理鹽水溶解MDP藥盒，取40 μl加入還原抗體中，再加入100 μl Na99Tcm04 (約370 MBq),室溫下振蕩15 min，即為標記抗體混合物，采用Sephadex G50柱層析純化獲得99Tcm-5E6抗體。單克隆抗體的放射免疫顯像：實驗鼠和對照鼠經靜脈注射純化的99Tcm-5E6(25 μg/只，約6.2~8.5 MBq)，2 h和6 h后分別進行SPECT顯像，顯像過程中，裸鼠用1.5%的異氟烷吸入麻醉，固定在SPECT掃描器的中央，用白熾燈照射裸鼠，維持裸鼠體溫37℃左右。顯像條件，配針孔式準直器，能峰140 kev，窗寬20%，矩陣256×256，采集時間5 min。

2結果

2.1重組質粒pET-32a-PSMA酶切鑒定重組質粒經KpnⅠ、XhoⅠ雙酶切，電泳顯示在相應位置出現條帶，與預期大小一致(見圖1)，表明重組質粒構建成功。

2.2PSMA膜外段多肽的鑒定與純化不同表達條件下目的蛋白表達見圖2，三種表達條件目的蛋白均有表達，25℃過夜目的蛋白表達量最多。利用標簽蛋白6×His對目的蛋白純化見圖3，收集經500 mmol/L咪唑洗脫下來的蛋白進行復性，濃縮備用。

2.3ELISA篩選及抗體效價測定小鼠脾細胞和Sp2/0小鼠骨髓瘤細胞融合后，共鋪5塊細胞96孔培養板，10 d左右取細胞上清經間接ELISA方法測定OD450nm值，選取其中陽性值最高的進行亞克隆篩選。經亞克隆篩選，共獲得3株能穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為5E6、4A5和4D7。ELISA法測定三株抗體的效價均在1∶25 6000以上。

2.4單抗的免疫球蛋白類型鑒定三株單克隆抗體均屬IgG型，其中，4D7屬IgG1亞型，5E6和4A5屬IgG2a亞型，見圖4。

2.5單抗的Western blot鑒定以300 ng重組蛋白上樣，待檢的抗PSMA膜外域單抗為一抗，HRP-羊抗小鼠IgG為二抗，進行Western blot檢測，結果如圖5。

2.6單抗的競爭抑制ELISA鑒定以重組抗原包板，以單克隆抗體5E6標酶，用標準抗原PSMA競爭抑制，重組抗原與標準抗原均能同制備的單克隆抗體5E6特異性結合并存在競爭抑制關系，競爭抑制曲線見圖6。

2.7動物模型放射免疫顯像SPECT顯像顯示：實驗組，99Tcm-5E6抗體注射后2 h，腫瘤部位可見放射性濃聚，注射后6 h，腫瘤部位出現明顯的放射性濃聚，而對照組，在注射99Tcm-5E6抗體2 h、6 h后，腫瘤部位始終未見明顯的放射性濃聚，見圖7。

3討論

前列腺癌雄激素去勢治療是初診前列腺癌的標準治療，但經過中位治療時間14~30個月后，幾乎所有患者都將進展為去勢抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer，CRPC)，其生存期明顯縮短，預后不佳[9,10]。近年來研究表明，以人前列腺特異性膜抗原(PSMA)膜外域為靶標的單克隆抗體對CRPC治療及前列腺癌轉移的探測具有一定效果[11,12]。可靠、穩定來源的抗PSMA膜外域單克隆抗體是前列腺癌免疫診斷及治療的關鍵。

單克隆抗體的制備有雜交瘤和基因工程兩大類方法，前者成熟、穩妥，但繁瑣耗時；后者簡便快速，但獲得的抗體親和性稍差，臨床應用受到一定影響，因此仍選傳統的雜交瘤技術制備單抗。單抗的制備抗原的選取是關鍵，由于抗體對抗原的識別，不是對抗原整個分子的識別，而是通過對抗原上的抗原表位進行識別，達到對抗原的特異性識別[13]。對于蛋白質抗原，并不一定需要表達全長蛋白作為免疫抗原，蛋白質N端或C端的300~400個左右的氨基酸是經常選擇的抗原片段。應用生物信息技術預測PSMA膜外域抗原表位，并對預測的PSMA膜外域水溶性好、抗原性強、特異性高的區域作為表達對象，此區域位于PSMA膜外域C端的aa440-aa750，共310個氨基酸進行原核表達。

對PSMA膜外域C端的310個氨基酸進行全序列基因合成，接入表達載體pET-32a中，構建表達載體pET-32a-r-ectodomain-PSMA。經KpnⅠ、XhoⅠ雙酶切后電泳顯示在相應位置出現目的條帶，與預期大小(930 bp)相符，表明成功構建了重組質粒。重組蛋白表達后經鎳離子親和層析純化，SDS-PAGE電泳分析，純化蛋白大小約50 kD與理論結果相符。將制備的目的蛋白抗原免疫BALB/c小鼠，篩選出3株分泌抗人PSMA膜外段單克隆抗體的細胞株5E6、4A5和4D7。體外能穩定傳代，細胞培養上清抗體效價穩定在1∶256 000以上。制備的單抗經鑒定均為IgG型，其中5E6、4A5為IgG2a亞型，4D7為IgG1亞型，Western blot結果顯示在50 kD處有特異性條帶，說明制備的三株單克隆抗體均能與重組蛋白特異性結合。競爭抑制ELISA試驗，重組抗原與標準PSMA抗原均能與單抗5E6競爭抑制性結合，進一步驗證了所制備單抗的特異性。

單克隆抗體放射免疫顯像結果顯示：99Tcm-5E6在裸鼠體內能特性結合PSMA陽性的前列腺腫瘤細胞，對前列腺腫瘤具有定位性能，在注射示蹤劑2 h、6 h后，腫瘤部位出現明顯的放射性濃聚，并使腫瘤初步顯像；而在PSMA陰性的對照組，99Tcm-5E6未能與腫瘤細胞結合，在腫瘤部位未見明顯的放射性濃聚。 因此，本研究應用生物信息技術和原核表達技術預測并表達PSMA膜外域多肽抗原片段，所制備的抗PSMA膜外域單克隆抗體能與動物模型體內活的前列腺腫瘤細胞抗原結合，具有較高的特異性。本研究建立了一套可靠、穩定的抗PSMA膜外域單克隆抗體制備方法，為前列腺癌靶向診斷及靶向治療奠定基礎。

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[收稿2015-06-05修回2015-09-15]

(編輯倪鵬)

Preparation and preliminary utilization of monoclonal antibodies specifically against an immunogenic fragment in ectodomain of prostate-specific membrane antigen (PSMA)

TAORong,NIZhen-Hua,YANGSheng,LIUChong,ZHUMin,SHENJiang-Fan，TUShao-Hua.PutuoHospital,ShanghaiUniversityofChineseTraditionMedicine，Shanghai200062,China

[Abstract]Objective:To prepare monoclonal antibodies specifically against an immunogenic fragment in ectodomain of prostate-specific membrane antigen (PSMA).Methods: An polypeptide immunogenic fragment in the ectodomain of PSMA was predicted by biological information technology,and then it was expressed prokaryotically.BALB/c mice were immunized with the prokarytically expressed recombinant polypeptide antigen,to prepare the monoclonal antibodies specifically against an immunogenic fragment in ectodomain of PSMA by hybridoma technology,purification of monoclonal antibody by affinity chromatography,characterization of the monoclonal antibodies by Western blot.The radioimmunoimaging in prostate cancer model was performed by using the labeled McAb.Results: Throught the software analysis,we got the antigen fragment in the ectodomain of PSMA containing 310aa sequences higher specificity,artificially synthesized gene sequence of the region,and constructed a prokaryotic expression vector pET-32a-r-ectodomain-PSMA,by prokaryotic expression we obtained the 50 kD target antigen,after hybridization,the three positive hybridoma cell lines (5E6,4A5 and 4D7) were selected by ELISA using target antigen,the isotypes of 5E6 and 4A5 were IgG2a,the isotypes of 4D7 were IgG1,the titer of three monoclonal antibodies was above 1∶256 000.Western blot results showed that the prepared monoclonal antibodies could binding specifically to the antigen in the ectodomain of PSMA.Radioimmunoimaging in prostate cancer animal model results further confirm that the prepared monoclonal antibodies could combinate with the antigen in the ectodomain of PSMA in the animal body,and make the tumor imaging.Conclusion: The prepared monoclonal antibodies can specifically recognizes the PSMA antigen,which laid the foundation for the immunodiagnosis and immunotherapy of prostate cancer.

[Key words]Prostate specific membrane antigen (PSMA);Monoclonal antibody;Prostate cancer

作者簡介：陶嶸(1964年-)，男，科主任，副主任醫師，主要從事分子影像學方面研究,E-mail:13801703538@163.com。

通訊作者②，E-mail:tush_99@163.com。

中圖分類號R392
①本文為上海中醫藥大學附屬普陀醫院院級課題(No.2013GQ014Ⅱ)。

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)02-0205-05

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.02.013

·免疫學技術與方法·