膿毒血癥中固有免疫細胞的調節機制研究進展①

黃 鶴 田昭濤 黎檀實

(解放軍總醫院急診科,北京100036)

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·專題綜述·

膿毒血癥中固有免疫細胞的調節機制研究進展①

黃 鶴②田昭濤②黎檀實

(解放軍總醫院急診科,北京100036)

1 文獻檢索Treg也是固有免疫細胞一部分

膿毒血癥是由潛在或已知感染因素引起的全身炎癥反應綜合征，其進展后可出現休克及多器官功能不全，是ICU病房病人死亡的主要原因。盡管基于靶向治療的分子學發病機制的研究大量開展，但嚴重膿毒癥和膿毒性休克的生存率近年來未得到明顯改善。宿主細胞介導免疫對深刻理解膿毒血癥及其多臟器損傷并發癥的病理過程至關重要。研究表明固有免疫細胞如中性粒細胞、巨噬細胞、樹突細胞、T淋巴細胞、調節T細胞、自然殺傷性T細胞(NKT)等在膿毒血癥期間維護機體內環境平衡和調節免疫反應中起到至關重要的作用，因此了解不同細胞的生物學特性和病理生理作用可能對于深入理解膿毒血癥免疫調節機制有幫助。本文綜合闡述幾種主要免疫細胞，為膿毒血癥治療提供新的方向。

膿毒血癥早期，感染引起宿主適度反應逐漸放大，隨之而來是調節異常。炎癥反應被固有免疫細胞部分介導，通過產生促炎細胞因子如TNF-α、TNF-γ、高遷移率族蛋白1(HMGB1)或者抑炎因子如TGF-β、IL-10等啟動或者抑制宿主炎癥反應[1-4]。本文簡要概述不同類型免疫細胞及新近發現的分子在膿毒血癥發展中的調節機制，并探討免疫細胞參與的嚴重膿毒癥早期診斷和治療。

2 膿毒血癥和宿主免疫反應

傳統認為膿毒血癥被定義為臨床綜合征，表現為發熱、心動過速、白細胞增多或減少以及其他炎癥性表現。它也意味著針對暴發性感染或失控炎癥不恰當的反應[5,6]。近來關于膿毒血癥根本發病機制的研究不斷開展，目前已明確膿毒血癥是全身炎癥反應綜合征。失血性休克、創傷和嚴重組織損傷、熱損傷、缺血再灌注損傷都可以引起全身炎癥反應綜合征[7]。目前的研究證實病原體和創傷能激活全身炎癥反應導致機體出現膿毒血癥的代謝和生理反應，但是免疫和炎癥的潛在機制仍需進一步闡明。目前公認全身炎癥反應綜合征可引起固有免疫系統廣泛激活和功能障礙[8]。固有免疫系統包括體液和細胞免疫。公認微生物引起固有免疫系統全身反應模式，大部分由釋放分泌性蛋白或細胞因子介導。然而，宿主固有免疫激活不僅發生微生物侵入后，也在細胞損傷、組織缺血缺氧及壞死時產生內部危險信號。固有免疫被充分激發，宿主反應可使患者出現炎癥反應綜合征，休克甚至多臟器功能衰竭。一般來說膿毒血癥早期，機體釋放大量促炎因子，包括TNF-α、TNF-γ、IL-33和 IL-2[9]。然而隨著病程延長，出現免疫抑制反應，包括巨噬細胞失活，抗原呈遞減少，淋巴細胞增殖活性受到抑制，導致釋放大量抗炎細胞因子，如IL-10、IL-13和 IL-27。輔助性T細胞向Th2轉換，伴隨大量淋巴細胞凋亡，可導致機體對感染易感性增加[10]。研究證實病人固有免疫細胞能夠促進抗炎細胞因子噴涌式釋放，轉換Th2型反應，病人表現出免疫抑制和代償性抗炎癥反應綜合征。因此，固有免疫和炎癥反應被認為是嚴重膿毒癥發病過程必不可少的。

3 中性粒細胞在膿毒血癥免疫反應中的功能

中性粒細胞雖大量存在于血液中，但正常組織是缺乏的，在白細胞中壽命短暫，離開骨髓腔后只有幾個月壽命，在膿毒血癥早期，骨髓中大量儲備成熟的中性粒細胞，可以快速激活，使循環血液粒細胞數量大量增加。膿毒血癥發生后，粒細胞大量積聚至膿毒癥位點[11]，有研究發現炎癥，膿毒血癥和代謝性疾病血液微粒含量增加，這些微粒可以從各種細胞釋放，比如粒細胞和紅細胞。粒細胞產生的微粒可能在膿毒癥早期是有益的，在免疫反應中被吞噬細胞激活，被旁觀者細胞滅活起到差異性作用[12]。與成熟中性粒細胞相比，未成熟中性粒細胞有較長存活期和抵抗凋亡的能力。TNF-α/IL-10比值較高的常規細胞，也能夠介導重要固有免疫功能但是效能較低[13]。

膿毒血癥中性粒細胞調節功能是復雜的，嚴重膿毒癥的粒細胞遷移失敗和壽命縮短已經明確。粒細胞遷移反應通過誘導細胞支架改變受細菌產物、細胞因子，炎癥趨化因子和免疫調節激素調節，通過多形核白細胞(PMN)內核細胞相互制約，通過G蛋白偶聯受體表達或發射信號進行修飾[12]。眾所周知PMN G-蛋白偶聯受體的失調，TLR表達和/或信號通路能可引起白細胞三烯功能改變，進一步導致促炎和免疫調節細胞因子抑制，活性氧類產物減少。另外，研究發現感染性休克血液中C5aR水平升高，粒細胞上C5a受體減少[14]。一系列受體功能通過粒細胞完成，表明免疫抗炎的重要機制。隨著組織損傷和全身炎癥加重，粒細胞遷移失敗可能導致腹膜滲出液和血液中細菌數量增加，其特征性表現為血液細胞因子數量增加和肺臟和其他臟器中炎癥趨化因子和中性粒細胞被扣留。因此，作為固有免疫中重要成分，粒細胞募集反應和遷移受損與膿毒血癥的發病機制和不良預后有關。

4 巨噬細胞在膿毒血癥免疫反應中的作用

巨噬細胞能夠誘導、吞噬、消滅外來入侵病原體，刺激細胞因子的釋放。人類嚴重膿毒癥和感染性休克可能誘發繼發性嗜血細胞綜合征，伴隨巨噬細胞活化綜合征(MAS)。MAS是以膿毒血癥中巨噬細胞過度活化為特征，Th1細胞因子分泌IFN-γ、IL-12和IL-18增加，促進巨噬細胞活化。巨噬細胞在機體固有免疫反應中起重要作用，存在形式由自身釋放細胞因子所決定，脾臟巨噬細胞釋放的Ι型IFN，能抑制促炎因子的分泌，被認為是膿毒血癥中導致T細胞免疫受損的關鍵因子[15]。膿毒血癥早期，炎癥和凋亡被認為是雙重致病因素，凋亡是程序化細胞死亡機制，包括免疫穩態調節和自身反應的淋巴細胞的清除，但是免疫細胞失控的凋亡可能使宿主消滅病原體能力減弱。中性粒細胞是抵御外來病原體的第一道防線，也經歷著細胞凋亡。細胞凋亡使粒細胞對細胞外刺激無應答，并被吞噬細胞識別、清除。膿毒血癥發病機制中加速炎癥進程的中性粒細胞凋亡同時也牽涉巨噬細胞凋亡。巨噬細胞在啟動、維持和分辨宿主炎癥反應中起著關鍵作用，巨噬細胞過度凋亡可引起機體免疫失衡和多臟器功能衰竭。膿毒血癥是復雜的機能紊亂，多重細胞因子介導信號通路可能促進凋亡的激活和加速炎癥反應。大量研究證實某些細胞因子如IL-1、IL-6和粒細胞集落刺激因子可以介導炎癥反應但不能抑制凋亡，另外一些細胞因子如IFN-α和HMGB1能夠誘導凋亡[16]。所以巨噬細胞凋亡可以發生在缺乏某些細胞因子或廣泛表達另外些細胞因子中，因此研究者將注意力集中在膿毒血癥進程中能導致巨噬細胞凋亡的細胞和體液免疫因素。HMGB1在巨噬細胞凋亡中起關鍵性作用。前瞻性研究發現將HMGB1與人結腸癌分泌型WiDr細胞共培養可導致PMA-U937和 U937 細胞生長抑制和凋亡。另外，HMGB1可能與小鼠腹膜巨噬細胞誘導凋亡關系密切，其效力是濃度和時間依賴性的[17]。HMGB1是普遍存在于哺乳動物組織細胞中進化高度保守的染色體蛋白，能夠調節核小體的功能和轉錄，研究發現它在膿毒血癥細胞外釋放炎癥介質，可以誘發巨噬細胞的凋亡。HMGB1是高級糖化終產物(RAGE)受體特異性配體，用rmRAGE/Fc可以阻斷HMGB1和RAGE產生作用， 表明HMGB1和RAGE誘導的巨噬細胞凋亡與 RAGE抗體的相互關系，證實了RAGE通過HMGB1介導是參與巨噬細胞凋亡主要受體之一[18]。HMGB1通過RAGE誘導細胞內信號傳導激活兩個不同級聯，一個是NF易位為NF-κB(HMGB1正向調節的轉錄因子，被激活巨噬細胞的另一個產物)[18]；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)級聯激發細胞毒性和凋亡功能是眾所周知的。被HMGB1處理的巨噬細胞caspase-3活性顯著增加。體外實驗證實caspase-3活性升高可以促進HMGB1誘導巨噬細胞凋亡[17]。在體外實驗中經LPS刺激，巨噬細胞釋放HMGB1的程度與caspase-3激活的凋亡發生相關[19]。

5 T調節細胞在膿毒血癥免疫調節中作用

根據亞型的特性功能，Treg可以分成自然Treg和適應性Treg。一般來說，自然Treg在胸腺成熟后進入外周淋巴組織，少數CD4+CD25+Treg在固有和適應性免疫反應發揮免疫調控作用[20]。獲得性Treg是一群在外周淋巴組織發育成熟與自然Treg功能相反的T細胞。他們暴露在非特異性抗原或者免疫抑制細胞因子后適應了抗原刺激T淋巴細胞的特殊環境，并且作為TGF-β產生Th3細胞和IL-10產生T調節1型細胞提呈。Treg在體內可以增殖，被效應T細胞和固有免疫系統其他細胞介導抑制免疫反應性。到目前為止Treg有四種不同免疫調節機制，最為重要的機制是免疫抑制和免疫無應答[21]。在臨床和實驗膿毒血癥研究中發現Treg的含量是增加的， Treg功能機制研究中發現細胞表面標志性分子的高表達，如CTLA-4和糖皮質激素誘導TNFR，這些分子與Treg免疫抑制功能息息相關。另外一些分子，包括Foxp3和TLRs,可以促進Treg的免疫抑制功能。近來，CD4+CD25+Treg上發現的煙堿型乙酰膽堿受體α7亞單位(7 nicotinic acetylcholine receptor，α7 nAChR)，是調節CTLA-4 和 Foxp3表達的受體，也是CD4+CD25+Treg發揮免疫抑制功能的重要免疫調節器[22]。Treg介導的免疫抑制功能狀態主要依賴于T細胞受體(TCR)信號通路活化誘發的Th1/Th2 轉換，Treg可以釋放大量抗炎細胞因子(IL-4,IL-10)，顯著地促進Th2免疫反應。目前明確Th1克隆系合成IL-2、IFN-γ淋巴毒素，而這些淋巴因子未發現表達在Th2克隆系。Th2克隆系能夠特異性合成IL-4和 IL-10。MacConmara等[23]研究發現損傷后7 d的患者，與正常組相比Treg的抑制能力增強，這可能是CD4+T細胞分化為 Th2 細胞的結果。觀察發現人類損傷后血液中Treg免疫抑制活性增強。在CLP誘導的膿毒血癥小鼠模型中，CLP后6 h Treg繼承性轉移在防止膿毒血癥進一步發展中起著保護效應[24]。這些體內和體外實驗結果表明在膿毒血癥和損傷中Treg在有效抑制自身免疫中必不可少。關于Treg在膿毒血癥中免疫無應答功能，有報道指CD4+CD25+Tregs可能促使維持免疫耐受，表現為對抗原刺激無應答和IL-2生成停止。CD4+CD25+Tregs仍有活性，增殖過程產生大量IL-2，但是增殖程度較CD4+CD25-T 細胞是低的[25]。研究發現休克后Treg比率增加，但這不是因為其增殖增加，而是效應T細胞數量減少。這可能與膿毒血癥期間Treg抵抗凋亡進程有關。此外，Treg可以通過Fas/FasL通路誘導和增加自體反應胸腺T細胞和單核細胞的凋亡，促使FasL綁定Fas，從而激活caspase-8[26]。結果證實Treg在膿毒血癥免疫失調中起著關鍵作用，雖然Treg具體參與調節機制有待進一步深入研究。

腫瘤壞死因子-α誘導蛋白-8樣分子2(Tumor necrosis factor-α induced protein 8 like-2,TIPE2)作為TNFAIP8家族成員之一，與TNFAIP8家族其他成員存在高度序列同源性 ，它優先表達在淋巴衍生和骨髓衍生細胞里，但也可以通過TNF-α被誘導存在于其他細胞類型中[27,28]。在TIPE2敲除小鼠模型與野生型小鼠比較膿毒血癥休克癥狀趨向加重和惡化，說明TIPE2在膿毒血癥休克預防中有直接作用[29]。它在膿毒血癥中具有類似Treg的負向免疫功能。通過Western blot和RT-PCR驗證TIPE的表達，發現BALB/c小鼠Treg細胞存在TIPE2表達，并發現它是一種胞漿蛋白。為了闡明TIPE2缺失如何影響Treg的免疫調節功能，有研究用siRNA沉默TIPE2基因研究TIPE2在CD4+CD25+Tregs潛在效應，體外實驗發現TIPE2缺乏的Treg細胞表面分子(CTLA-4和 Foxp3)表達和細胞因子(IL-10 和TGF-β)大量下調。TIPE2沉默可以增加IFN-γ/IL-4比值，T淋巴細胞NF-AT活化增強。同時T細胞增殖和分化也顯著提升，IL-2表達水平升高。這些結果證實TIPE2是新型的負向調控蛋白，在膿毒血癥中參與了Treg介導的免疫抑制功能。

6 T淋巴細胞介導免疫與膿毒血癥

T淋巴細胞在機體抵抗微生物侵襲的免疫應答中起非常重要的作用，T淋巴細胞發育成熟于胸腺，入血液循環，進入外周免疫器官定居，并循血液→組織→淋巴→血液進入淋巴細胞再循環分布全身。在抗原暴露周圍聚集，它們可以通過暴露其表面的抗原受體TCR與主要組織相容性復合物(MHC)分子結合識別出異體蛋白的氨基酸碎片。根據不同的發育途徑及生物功能，T細胞亞基可以分為CD4+輔助性T細胞(Th)和CD8+細胞毒T細胞[30]。CD4+Th細胞識別區分暴露在專門抗原呈遞細胞(APCs)Ⅱ MHC分子提呈的抗原肽，而細胞毒性CD8+T細胞識別Ⅰ MHC分子提呈的抗原肽[31]，未成熟CD4+T 細胞進一步分化為輔助/效應T細胞。Th17亞型是CD4+T 細胞上超過2個功能的獨特種群，可以直接調節免疫應答，維持固有和同族免疫系統平衡。Th1 細胞介導細胞免疫，演化為應答細胞內致病毒；Th2細胞介導體液免疫，清除寄生蟲時產生獲得性免疫，促使宿主免疫下調。Th17 細胞可分泌標記細胞因子IL-17誘導一系列組織反應，是病原體和調節炎癥反應的關鍵分子[32]。CD4+CD25+Tregs分泌抗炎細胞因子，如IL-10、TGF-β參與嚴重創傷及膿毒血癥中的免疫抑制狀態，另外，γδT細胞在燒傷及膿毒血癥患者中發揮潛在作用，Th1 和 Th2細胞分泌細胞因子，啟動中性粒細胞介導的組織破壞和傷口愈合。研究發現燒傷早期，脾臟CD8+CD11b+γδT細胞數量增多，同時抑制淋巴細胞增殖，與γδT細胞相比較而言，CD8+CD11b+γδT細胞主要分泌Th2細胞因子，將這些細胞回輸到正常小鼠可以增加對創傷的易感性[33]。最近研究發現，低氧誘導性因子(HIF-1α)通過保護性ATP敲除和選擇性下調凋亡的途徑協助 LPS誘導IL-6表達。T細胞HIF-1α基因敲除可以阻斷其在低氧含量炎性組織的抑制作用，從而改善膿毒血癥患者的生存率[34]。在膿毒血癥發展過程中，一系列證據表明T淋巴細胞在細胞介導免疫應答中起關鍵性作用，包括顯著減弱增殖活力及突出的Th2免疫反應，Th2 細胞介導免疫反應之初伴隨大量淋巴細胞凋亡，可能造成對炎癥反應易感性增加[35]。

細胞凋亡參與膿毒血癥病理生理學機制是非常關鍵的，目前認為T淋巴細胞凋亡在免疫抑制和病情危重程度判斷中至關重要，通過脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導缺口末端標記法(TUNEL染色)，在盲腸結扎穿孔(CLP)膿毒癥小鼠和臨床證據結果有良好相關性[36]。先前研究有效證實多重凋亡途徑參與膿毒血癥，包括內源和外源途徑，內源途徑主要依賴于促凋亡和抗凋亡蛋白。在膿毒血癥過程中，T細胞上促凋亡蛋白Bim升高，抑制凋亡分子(Bcl-2和Bcl-xL)減少。在CLP致膿毒癥小鼠模型中T淋巴細胞選擇性過表達Bcl-2和Bcl-xL可以保護性抵抗淋巴細胞凋亡，顯著改善生存率。凋亡外源性通路能夠被Fas配體(FasL)和Fas相關受體激活，CLP介導的膿毒血癥小鼠中下調caspase-8 可以減少T淋巴細胞的凋亡，改善生存率。另外內源和外源途徑，內質網(ER)應激介導通路通過激活大量重疊的級聯(caspase-12)也參與T淋巴細胞的凋亡。但是具體的調控過程還需要進一步的深入研究。近來發現在膿毒血癥中細胞凋亡通路與內源和ER或者外源介導通路交錯并行[37]。

T細胞凋亡能夠影響固有免疫反應，例如在最初24 h可以減少IFN-γ和 IL-17的生成，巨噬細胞吞噬死亡T細胞和IL-10和TGF-β的產生的能力有所增強。膿毒血癥中糖皮質激素可促進胸腺細胞凋亡，被認為最佳臨床治療方案。在膿毒血癥適應性免疫中適當的細胞凋亡可以下調炎癥反應，對于宿主是有益的；但是免疫細胞的過度丟失，會中和宿主抵御侵入病原微生物的能力，最終導致膿毒血癥死亡，因此加強T淋巴細胞凋亡在改善膿毒血癥預后上起重要的作用。

7 NKT細胞在維持膿毒血癥免疫穩態的作用

眾所周知膿毒癥性休克免疫的失衡是最初的炎癥逐步惡化隨之快速進入抗炎反應的過程。后期的免疫麻痹階段是以T淋巴細胞、NK細胞、B細胞功能低下和抗炎細胞因子釋放增加為特征的。NKT細胞是αβ T細胞的亞組，作為固有和適應性免疫的一部分，通過Th1/Th2細胞因子和炎癥趨化因子產生，激活免疫系統其他成員和細胞溶解的效應器有效調節免疫[38]。NKT細胞可以分為兩個不同類型：Ⅰ型NKT細胞又叫iNKT和Ⅱ型NKT細胞。它們的活化是嚴格按照MHCⅠ相關糖蛋白CD1d，通過糖脂和脂類抗原被NKT細胞識別。與Ⅱ型NKT細胞相比，目前iNKT 細胞研究相對較少。作為T淋巴細胞的亞型，在人類iNKT細胞表達半不變量α/βTCRs包括一個不變量的Vα24/Jα18鏈和一個受限的β鏈。在與TCR識別后可以迅速分泌大量細胞因子，如IL-2、IL-4和IFN-γ[39]。研究證實NKT細胞可能參與了膿毒血癥的病程發展。

NKT細胞在維持機體免疫穩態中起到重要作用。最新一些研究數據表明NKT細胞在嚴重膿毒血癥中起到負面作用。膿毒血癥早期，一些促炎因子數量增加，隨著膿毒血癥病程延長，包括IL-10 和 IL-4在內的抑制型細胞因子產生增多，限制了免疫細胞激活和增殖，負向調節炎癥。NKT細胞能夠分泌大量細胞因子包括促炎和抑制型因子(IFN-γ和 IL-4)。激活的iNKT細胞產生IL-4比起其他細胞因子更加快速。iNKT細胞分泌細胞因子能夠激活其他類型的細胞，包括DC細胞、巨噬細胞、B細胞和傳統T細胞。NKT細胞有大量細胞表面標志物和功能與T細胞、NK細胞類似。如同T細胞、NKT細胞在識別不同抗原后表達TCR，啟動不同的免疫應答。幾乎所有NK細胞表達NK1.1，但是不是所有的TNK細胞，它們都和其他免疫細胞串聯共同搭建固有和適應性免疫系統[40]。

值得注意的是，NKT細胞和Treg細胞更為相似， 在嚴重膿毒血癥階段Treg釋放細胞因子如TGF-β和IL-10,能夠誘導抗炎或者免疫抑制反應。NKT細胞與Treg相似能夠產生或誘導這類細胞因子，但是免疫反應漂移至Th1或Th2取決于激活條件。除了細胞因子產生，NKT細胞能通過Fas/FasL和穿孔蛋白通路誘導細胞毒性效應器活化[41]。

新近實驗研究表明在膿毒血癥啟動之初NKT細胞能精確的啟動和調節炎癥和免疫級聯反應。在靜脈注射脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導內毒素血癥模型中iNKT細胞含量增多，也產生大量IFN-γ，但是IL-4的含量微乎其微。Fusakio等[42]證實幼稚NKT細胞和NK細胞檢測出補體受體C5a(C5aR)和 C5a受體樣 2(C5L2)mRNA表達。C5aR 缺乏的NKT細胞血清中IFN-γ和TNF-α減少，生存率大大提高。經抗CD1d阻斷抗體預處理的小鼠不僅IL-6 和 IL-10減少，而且生存率提高，結果證實NKT細胞的活化在膿毒血癥早期調節固有免疫、全身炎癥反應及生存率上發揮重要作用。

8 DC細胞在膿毒血癥免疫功能的影響

DC細胞在病原體識別和誘導特異性免疫反應以消除感染宿主病原體中非常重要。它們是專職抗原遞呈細胞，擅長瞄準，俘獲抗原從二級淋巴組織運輸到淋巴器官[35]。DC在不同條件下展現不同的功能來實現生物效應。當非特異性免疫系統被病原微生物和器官損害所激活，DC不僅提呈外源性抗原和同質抗原，也活化效應T淋巴細胞，誘導Treg增殖，從而決定炎癥和抗炎的免疫反應的類型。然而，Treg的產生或者被DC誘導的效應T淋巴細胞取決于它們的成熟狀態，即未成熟與成熟DC的比例。從功能角度看，DC細胞能夠分離為未成熟抗原捕獲細胞和成熟的免疫刺激細胞。與成熟DC相比，未成熟DC的數量能夠低表達CD11c和高表達CD45RB。另外它們可少量表達共刺激分子(CD80,CD86)和主要組織相容性復合體(MHC)Ⅱ，以胞漿細胞出現和未成熟表型為特征，激活后分泌高水平IL-10。在創傷燒傷后這些CD11clowCD45RBhighDCs能夠顯著抑制促炎細胞因子產生，幫助小鼠抵御嚴重膿毒血癥[43]。DC在宿主抵抗力和免疫原性中發揮重要作用，不同的病原體刺激呈現不同TLRs和細胞因子表達。TLRs興奮可能刺激髓樣分化因子88(MyD88)信號通路,MyD88可以增強促炎因子的釋放。

DC細胞是從外周單核細胞分化而來，表達TLR1,2,4,5和 8。在LPS刺激時，它們大量生成TNF-α和 IL-6。在多種微生物誘導的膿毒血癥中TLR2 和 TLR4參與此機制導致脾臟DC細胞耗盡[44]。在CLP后8 h脾臟分離的DC細胞CD86的表達大大增強，CD80無改變。而淋巴結DC同樣正向調節CD86 和 CD80表達。CLP后CD80缺失小鼠與正常組小鼠或CD86缺失小鼠比較生存率有所提高。在人類單核細胞上調CD80和結構CD86表達缺失呈現病情加重趨勢，預示CD80和CD86在膿毒血癥固有免疫反應的炎癥調節中呈現差異性作用。最近，有報道內質網應激(ERS)反應不僅參與T細胞分化和可塑性，還參與了DC細胞發育成熟[45]。內質網(ER)，作為真核細胞最為重要的細胞器之一，對免疫穩態的改變非常敏感。為適應ERS，哺乳動物細胞觸發未折疊蛋白反應(Unfolded protein response,UPR)信號通路以應對應激條件和監控ER蛋白質折疊能力，傳送信息調節ER的環境，維持細胞代謝，甚至決定細胞的命運。Zhu等[46]研究證實HMGB1可以通過調節ERS反應和UPR通路誘導DC細胞成熟和活化，調節其功能，為研究膿毒血癥免疫中內生來源細胞壓力在DC細胞關鍵作用提供廣闊視角。

目前，以特殊的表面標志物CD11clowCD45RBhigh表達為特征的DC亞群調節功能被廣泛研究。調節性CD11clowCD45RBhighDC細胞能夠通過釋放大量抑制細胞因子(IL-10)和少量炎性因子(IL-12)來影響免疫活性，從而發揮免疫調節效應。Fujita等[47]體外研究中發現調節性DC細胞通過小鼠抵御微生物病原體時膿毒癥反應的固有免疫中培植骨髓細胞獲得。同樣，有報道示CD11clowCD45RBhighDC細胞能夠誘導抗原特異性耐受，保護小鼠熱傷后免受LPS導致的宿主炎癥反應。在高劑量LPS注射小鼠，調節性DC細胞和傳統DC細胞快速增殖，這些細胞能夠被炎性刺激所激發[48]。眾所周知，膿毒血癥可使得骨髓中固有DC細胞減少。為了應對多種微生物致膿毒血癥，骨髓中DC前體細胞發育成調節性DC細胞修復啟動Th1和激活NK細胞，從而調節免疫抑制反應。因此CD11clowCD45RBhighDC細胞調節能力增強與失控炎癥反應相關伴隨組織器官的破壞。膿毒血癥中不同DC細胞的潛在功能和明確的病原學分子機制尚未闡明。在細胞激活進程DC細胞和HMGB1相互關系及HMGB1在天然存在CD11clowCD45RBhighDC細胞的作用被廣泛研究。研究發現與CD11clowCD45RBlowDC細胞比較，經HMGB1刺激后CD11clowCD45RBhighDC細胞比率顯著升高，體外實驗證實HMGB1可以促進DC細胞分化成CD11clowCD45RBhighDC，使T淋巴細胞免疫功能受到抑制及Th1 向Th2 轉化[49]。

9 嚴重膿毒血癥免疫功能的治療調整

免疫調節治療應用于嚴重膿毒血癥治療是非常重要的方法。目前，許多分子生物技術得到長足發展，成功用于識別和發現感染性疾病的微生物和膿毒血癥早期診斷。同時，嚴重膿毒血癥的治療策略有所進展。研究發現大麻素受體2在膿毒血癥中發揮正向調節作用，可以減少白細胞的激活和炎癥介質生成[50]。大麻素受體2激動劑治療能降低血清IL-6水平，加強中性粒細胞激活和p38活力，盡管大麻素受體2在暴發性感染免疫反應中作用有相反結果報道，但其在膿毒血癥中治療的潛力值得關注。Wang等[51]發現肝臟X受體，作為細胞核受體家族的轉錄因子，在CLP誘導膿毒血癥實驗中有防護肝臟損傷的重要作用。另外，在膿毒血癥不同階段，參與保護性免疫和免疫病理學的固有免疫細胞也起著關鍵作用。膿毒血癥中炎癥性級聯過度激活皆源于固有免疫細胞大量活化，分泌高水平炎性因子。所以，引入有效的免疫調節治療非常重要，可避免造成膿毒血癥患者不良預后風險增加的抗生素不規范使用。在嚴重膿毒血癥，存在各種免疫細胞的凋亡，如MODS發展過程的巨噬細胞、T細胞、DC細胞和血管內皮細胞。大量研究發現細胞凋亡參與膿毒血癥發生發展的病理生理過程，因此，對膿毒血癥細胞死亡預防也是有潛力的治療靶點。Annane等[52]研究表明低劑量氫化可的松治療能夠減少感染性休克的死亡率和改善生存期。凋亡是通過內部和外部信號通路所調節，也可通過ERS介導途徑。大量證據表明Bid和 Bim缺乏的CLP誘導膿毒血癥小鼠生存期延長，而T細胞過表達Bcl-2能減少小鼠死亡率，表明小片段RNA干擾(SiRNA)技術有希望成為膿毒血癥治療新方向[53]。外在信號通路相關蛋白的功能研究仍處于試驗階段，如多重死亡受體或配體的抑制，下調FasL表達和通過SiRNA 干擾Fas的表達，可以降低死亡率。合成的SiRNA，是活化 caspases的潛在抑制劑，如caspase-8和caspase-3的SiRNA，能夠改善CLP小鼠生存率。另外，內在和外在凋亡信號通路上細胞因子的靶向治療，也可改善膿毒血癥患者預后。例如IL-7能上調Bcl-2,促進T細胞存活，也通過減少CD4+和CD8+T 細胞凋亡及促進免疫效應T細胞功能能夠提高膿毒血癥小鼠生存率。總之，很多細胞因子與膿毒血癥介導T淋巴細胞的凋亡信號通路密切相關，因此SiRNA治療通過減少細胞凋亡提供新的可選擇的治療。目前凋亡通路上有多個靶點被發現，抗凋亡治療已經進入膿毒血癥臨床試驗階段。DC細胞作為調節免疫系統的一個靶點被廣泛研究。一些體外實驗顯示DC細胞可以誘導T細胞介導免疫反應，可用于疫苗的研制和疾病的治療。DC免疫法可以預防小鼠免患腫瘤、病毒和細菌疾病。膿毒血癥DC細胞表型反應修飾展示了新的治療途徑。在膿毒血癥體內實驗中發現T細胞凋亡增加與DC細胞表型有關，其修飾作用可以改善膿毒血癥預后。與T細胞死亡相比，CLP模型DC細胞的耗竭相對延遲，這個進程在膿毒血癥進程中非常重要[54]。目前研究通過遺傳和轉染腺病毒方法處理DC表型可中斷膿毒血癥發展進程。雖然這種改變的表型被成功用于治療自身免疫性疾病，但在急性炎癥疾病的治療包括膿毒血癥的治療中目前仍處于實驗階段。Laudanski等[55]證明DC細胞的移植可以逆轉膿毒血癥后宿主長期免疫抑制狀態。針對多種微生物的膿毒血癥，骨髓DC前體細胞可能發展成調節DC細胞減弱了Th1和 NK 細胞的功能，從而導致免疫紊亂。所以骨髓DC前體細胞分化的正常化可減少宿主對二重感染的易感性，可改善膿毒血癥預后。在嚴重損傷或膿毒血癥患者和動物Treg的抑制能力有放大作用。Treg消耗可被抗CD25抗體誘導，對膿毒血癥有保護作用。然而，CD25并不是Treg的唯一標志物，Foxp3 和 CTLA-4也參與Treg的調節。更多的特異性靶向治療研究不斷興起，經黃芪多糖(APS)預處理的膿毒血癥小鼠，Foxp3 表達和IL-10的產生都顯著減少，隨之而來效應T淋巴細胞的IL-2增殖活性和IL-2Ra表達恢復，說明APS可以減少CD4+CD25+Treg的活性和免疫抑制功能，因此有望用于膿毒血癥免疫抑制期的治療。此外，Hiraki等[56]發現Treg在膿毒血癥患者分離的外周血淋巴細胞中的含量顯著增加，Treg可中和IL-10或者TGF-β發揮調節功能對膿毒血癥的治療有價值。目前，多黏菌素B固定纖維(PMX-F)的 血液灌流在免疫功能重建中的作用值得關注。PMX-F治療膿毒血癥患者顯著減少Treg數量和血清IL-6 和IL-10水平[57]，以上研究表明Treg在創傷/膿毒血癥調節抗炎免疫反應中有極其重要的作用。基于Treg已知的特性，Zhao等[58]研究姜黃素對Treg的影響機制，姜黃素刺激Treg后Foxp3和CTLA-4表達，抑制型細胞因子分泌，IL-2 和IL-2Rα產生，p65核轉運及 c-Rel都顯著下調，預示姜黃素可用于膿毒血癥中與Treg相關的各種失調的免疫治療。此外TIPE2在Treg介導免疫也發揮重要作用，體外實驗中TIPE2缺失小鼠Treg活化并未明顯增加， TIPE2治療膿毒血癥的有效性在動物實驗和臨床研究中得以證實。除了上述免疫細胞，經硫苷脂處理NKT細胞活化增強，可調節iNKT細胞的無反應性，預示它在與iNKT細胞有關的炎性疾病如抗癌抗細菌免疫，自身免疫疾病及哮喘的治療中有應用潛力[59]。

目前，膿毒血癥增強NKT細胞免疫調節的靶向NKT細胞治療得到重視。有研究發現α-半乳糖神經酰胺(α-GalCer)處理后,存活動物呈現iNKT細胞增殖旺盛，Th1細胞因子水平較低，Th2 細胞因子分泌增多，表明α-GalCer在調節和影響iNKT細胞應對免疫抑制狀態中有良好效果[60]。載脂蛋白 E(apoE)可以調節膿毒血癥免疫反應，通過低密度脂蛋白受體(LDLR)處理NKT細胞影響膿毒血癥預后。通過apoE拮抗作用可以降低膿毒血癥小鼠死亡率，減少NKT細胞增殖和細胞因子釋放[61]。鑒于NKT細胞的治療價值，NKT細胞在膿毒血癥不同階段的免疫功能調節中發揮了更為精準的靶向作用從而減少副作用。

10 總結

嚴重膿毒血癥和感染性休克在重癥監護病房有很高發病率，它可導致宿主固有免疫和適應免疫的激活和機能紊亂，固有免疫細胞亞群通過調節多重受體表達或者細胞因子分泌在膿毒血癥/急性損傷的免疫反應中有深遠的影響，同時也影響膿毒血癥的發展與轉歸。隨著我們對危重病的發病機制深入理解，我們推測膿毒血癥是與免疫系統密不可分的疾病，膿毒血癥固有免疫反應是被多種免疫細胞和導致功能紊亂的環境因素所調節。因此明確固有免疫細胞參與的調節機制為精準評估患者免疫狀態提供機會，有望成為早期膿毒血癥的免疫調節治療的新策略。

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[收稿2015-08-13]

(編輯 張曉舟)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.04.029

黃 鶴(1979年-)，女，在讀博士，主治醫師，主要從事危重病救治方面的研究。

R392.12

A

1000-484X(2016)04-0576-08

①本文為衛生部科研專項經費項目(201302017)。

②濟南軍區總醫院重癥醫學科,濟南250031。