波形蛋白在細胞內外的不同功能與相關病理①

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波形蛋白在細胞內外的不同功能與相關病理①

陳卓方成

(武漢輕工大學醫學院移植免疫實驗室，武漢430023)

真核細胞骨架是由微管、微絲、中間絲(Intermediate filaments，IFs)構成的蛋白纖維網狀支架系統。IFs根據基因序列分為六種類型，不同類型中間絲的表達具有明顯的組織細胞特異性。波形蛋白(Vimentin，Vim)為Ⅲ型中間絲蛋白，主要表達于中胚層起源的間充質細胞中，如成纖維細胞、內皮細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等。Vim在感染、腫瘤、自身免疫、固有免疫等多方面顯現復雜的功能特性。

1Vim的結構

Vim基因在不同脊椎動物中序列高度保守。人Vim基因位于染色體10p13上，含9個外顯子，開放讀碼框架1 401 bp。Vim單體由466個氨基酸殘基組成為絲狀纖維分子，相對分子質量約為53 kD。

Vim單體由頭部非螺旋氨基(N)末端(103個氨基酸)、尾部非螺旋羧基(C)末端(55個氨基酸)和中間的桿狀主域(308個氨基酸)構成。中間桿狀結構域的四段高度保守的α螺旋(1A、1B、2A、2B)由三個連接區域(L1、L12、L2)連接形成兩個卷曲的超螺旋結構。N端和C端結構域的氨基序列具有高度多態性，都存在含磷酸化靶點的高度伸展結構域。磷酸化修飾為Vim形成復雜結構、產生不同功能提供動力，也使Vim能夠參與信號傳導[1]。

每兩個Vim單體分子平行排列形成1個超螺旋二聚體，每兩個二聚體反向平行形成沒有極性的四聚體，多個四聚體首尾相連構成一根原纖維，每8根原纖維平行并聯成1根直徑10 nm的中空圓柱狀Vim纖維。免疫熒光標記Vim纖維，可觀察到在胞內有長纖維、短纖維和非纖維顆粒形態[2]。Vim單體在體內、外均可自行迅速聚合成Vim纖維，此過程不需要ATP或者GTP，僅受離子強度的影響。但若desmin(結蛋白)存在，Vim單體更易與desmin單體聚合成異聚體纖維。Vim的同源多聚體與異聚體纖維為其在胞內常有的兩種形式。Vim纖維依賴磷酸化/去磷酸化調控聚合/解聚的動態平衡，此平衡受Ⅲ型IFs結合蛋白網格蛋白(Calthrin)調控。

2Vim胞內功能與相關病理

免疫熒光標記顯示真核細胞內Vim呈放射性波浪狀細絲，與細胞核膜、細胞器、細胞膜連接，以維持胞內完整的亞細胞結構及細胞的正常形態。目前相關研究發現Vim與腫瘤、感染、炎癥發展、固有免疫等有密切關系，這些病理狀態的形成與Vim在真核細胞分化、黏附、移行、信號傳導和凋亡等功能中起到的重要作用密不可分。

2.1細胞骨架功能與凋亡正常成纖維細胞為梭形細胞，具有典型的肌動蛋白(Actin)細胞骨架和Vim細胞骨架，并且成纖維細胞特異性蛋白(Fibroblast-specific protein 1，FSP1)正常表達。靶向破壞Vim細胞骨架后發現，成纖維細胞形態發生明顯改變，由典型的間中質梭形向球形轉變，FSP1表達下調，actin網絡結構也明顯改變[3]。 Vim KO小鼠內皮細胞核形態也有內陷、褶皺現象。Vim降解或突變誘發Caspase凋亡信號促使細胞凋亡。激活的Caspase家族進一步降解Vim成碎片和顆粒物聚集在細胞核周圍，同時Vim與細胞核的聯系完全或部分消失引起細胞核凝集及核碎片化，細胞表現出變圓或細胞質收縮等凋亡特有形態。這些碎片又進一步促進Caspase活化，引起凋亡信號的級聯放大。Lahat等[4]發現WFA(Vim特異抑制劑)環氧基團與Vim半胱氨酸殘基高度特異性結合，誘導Vim降解，明顯抑制組織肉瘤和有上皮性-間質表型腫瘤的生長和復發。Rodriguez等[5]發現Vim會隨著PARP1(基因組功能相關蛋白酶)下調而解聚，誘導凋亡發生，抑制黑色素瘤細胞的生長和復發。

2.2調節細胞黏附、遷移功能與間充質化在細胞黏附功能中整合素家族起關鍵作用，其胞內段能招募如網蛋白、黏著蛋白和Vim等細胞骨架蛋白，然后向細胞內部轉導信號及產生黏附有關的生理功能。Vim調節細胞黏附可能有2種途徑。一是Vim識別整合素和黏附分子，形成胞外的錨定結構(橋粒和半橋粒)，以維持細胞間的錨定銜接。如在內皮細胞中Vim與整合素αVβ3直接結合形成FAS(黏著斑)，以維持細胞的黏附狀態及黏附傾向性[6]。纖維母細胞的FAS通過網蛋白1f(Plectin isoform 1f，P1f)與Vim結合后，使Vim纖維絲形成籠狀結構圍繞于細胞核周圍，加強了細胞與胞外基質的連接，該結構對維持細胞的形態、極性和細胞間的黏附具有重要作用[7]。二是胞漿中Vim結合囊泡形式的Integrin-β1(整合素β1)，囊泡上的PKCs途徑使結合其上的Vim頭部磷酸化，整個結合體到達胞膜上特定部位后依賴PKCs途徑去磷酸化釋放囊泡至胞膜表面，Vim重新進入胞漿再次運輸Integrin-β1。這種PKCs依賴的Vim磷酸化/去磷酸化過程，對調控整合素黏著斑、調控黏附位點大小、穩定內皮細胞必不可少[8]。有研究證實Vim敲除后會抑制HEK-293和3T3細胞在膠原中的遷移和延伸，且細胞黏附能力、Integrin-β1的表達及其激活都下降了50%以上[9]。

上皮細胞-間充質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)，是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程。Vim是此過程中間質細胞的標志物。EMT過程中，Vim在上皮細胞高度表達，角蛋白骨架轉化為Vim細胞骨架，上皮細胞轉變成為間質細胞，細胞極性消失、黏附能力減弱、運動能力增強。

Ⅱ型EMT包括損傷修復、組織再生和器官纖維化相關的EMT。通過纖維細胞的產生以修復由創傷和炎癥反應造成的組織損傷。當炎癥反應緩解后該轉化過程即自行停止。然而炎癥反應持續活化，Ⅱ型EMT過程也將持續存在，最終造成器官纖維化。Menko等[10]發現當人眼晶狀體受到損傷，損傷邊緣的某些晶狀體上皮細胞(修復祖細胞)會轉變成修復細胞。Vim大量表達于修復細胞的偽足處使得修復細胞快速遷移和擴散，修復損傷邊緣。并首次發現Vim通過與myosinⅡB結合調節修復細胞遷移及損傷修復的能力。

Ⅲ型EMT是指與上皮細胞惡性腫瘤相關的表型轉化。原發性上皮組織腫瘤細胞通過Ⅲ型EMT形成具有遷移能力的間充質細胞，隨血流轉移至不同部位，再通過MET(間質細胞-上皮化)過程形成上皮細胞的腫瘤轉移灶。Rodriguez等[5]發現Vim的高表達能誘導黑色素瘤細胞的促轉移表型增加，包括：ILK(整合素連接激酶)/GSK3-β依賴的E-鈣黏素(內皮正常細胞的標志物)下調，Snail1的激活，增加了細胞的遷移力，促進EMT的發生。丁隆等[11]研究miR-22基因對肝癌細胞表型轉化的作用發現，miR-22調控腫瘤細胞表型轉化成間質型細胞時，Vim表達量上調。

2.3協同蛋白功能與免疫CD病(胃腸道慢性肉芽腫)是宿主對AIEC(黏黏-侵襲性大腸桿菌)的固有免疫應答缺陷導致的。Stevens等[12]發現Vim是NOD2的協同蛋白。NOD2的LRR(富含亮氨酸重復單位)區內功能性組件L1007fs、R702W、G908R與Vim相關位點結合，才能識別AIEC的MDP(胞壁酰二聚糖)，從而激活NF-κB通路，啟動細胞自噬并殺滅AIEC。胞漿中的模式識別受體NOD2的基因突變，是導致CD病的唯一因素。CD病相關的基因多態性，使L1007fs、R702W不能定位與Vim的結合，出現免疫應答缺陷。

Tolstonog等[13]發現Vim KO小鼠胚胎成纖維細胞中，線粒體呼吸鏈的氧化磷酸化偶聯過程比正常細胞弱，細胞核及核周區域中大量積聚ROS(活性氧簇)，導致氧化性損傷。ROS是需氧細胞在代謝過程中產生的，包括：O2-、H2O2及HO2-、OH-等。高濃度的ROS可通過細胞氧化應激反應誘導細胞凋亡甚至導致其壞死。Mor-Vaknin等[14]發現，在腸道上皮細胞內Vim與Nox(NADPH氧化酶)的活性亞單位p47phox 結合使Nox處于抑制狀態，Nox是產生ROS的主要酶體，故而ROS處于低水平。腹腔注射大腸桿菌感染Vim KO小鼠能夠比WT(野生型)小鼠更好的控制細菌感染。同時體外實驗揭示Vim KO的BMM(骨髓來源傳代巨噬細胞)能夠產生大量的ROS介導殺滅細菌，殺菌能力顯著增強。提示Vim作為Nox的協同蛋白，調節巨噬細胞產生ROS的能力。Ise等[15]發現吞噬細胞表面的Vim與凋亡細胞中的配體N-乙酰氨基葡萄糖激酶(O-GlcNAc)結合，刺激絲氨酸第71位點發生磷酸化，參與對凋亡細胞的包裹與清除。

2.4受體功能與感染PRRSV(豬繁殖與呼吸綜合征病毒)主要侵害豬的巨噬細胞系統，引發免疫缺陷，從而導致如間質性肺炎、淋巴結壞死、病毒血癥、腦炎等疾病。馬曉春等[16]證實Vim及其多克隆抗體均能阻斷PRRSV感染Marc-145易感細胞系。重組波形蛋白轉導到PRRSV非易感細胞系PK-15中使之獲得了易感性，證實Vim是PRRSV受體復合物的一部分。

Garg等[17]發現被結核分枝桿菌感染的細胞表面大量表達Vim，Vim能與NK細胞表面的NKp46受體結合，使感染的細胞死亡，以對抗細菌感染。Chi等[18]用人腦微血管上皮細胞證實Vim是IbeA1(大腸桿菌侵襲素)調節的E.coli(大腸桿菌)K1-信號傳導的受體。這個菌株誘發新生兒細菌性腦膜炎。

Kanlaya等[19]發現Vim在登革病毒(Dengue virus，DV)感染后與核糖核蛋白(hnRNP)及病毒NS1蛋白相互作用形成復合體，用丙烯酰胺破壞Vim后該復合體不能形成，病毒NS1蛋白也表達下調，病毒的復制和釋放量顯著下降。提示Vim在DV的復制及釋放中發揮著重要作用。

3Vim胞外功能與相關病理

3.1自身抗原特性與自身免疫凋亡的巨噬細胞中Vim經過肽基精氨酸脫亞胺酶(Peptidyl-arginine deiminase，PAD)瓜氨酸化形成的cVim(瓜氨酸化波形蛋白)，是RA(類風濕性關節炎)的主要抗原之一。其自身抗體(抗-Sa，抗-MCV)是ACPA(抗瓜氨酸化抗體)中的主要高度特異性抗體，是早期RA嚴重程度的重要指標。含大量cVim的ICs(抗原抗體復合物)特異性地存在于關節滑膜中，刺激FLS(成纖維樣滑膜細胞)分泌各種蛋白酶類、花生四烯酸代謝產物及細胞因子，促進關節損傷。宗明等[20]發現cVim增加DC的抗原提呈作用，能在局部誘發T細胞介導的免疫反應，調節炎癥因子如IL-10、IL-12的分泌，為cVim誘導RA發生提供新證據。Carrier等[21]發現cVim可與HLA-DR(MHC Ⅱ型類分子)結合，提示cVim參與介導炎癥持續，也可能為RA 發生的機制之一。

ARF(急性風濕熱)是由異常免疫反應引起的多系統自身免疫疾病，GAS(甲類鏈球菌)咽炎傾向的人群多發。ARF反復發作病例中30%～50%的患者伴有慢性心臟瓣膜損傷。抗鏈球菌A型抗體和AECA(抗內皮細胞抗體)是風濕性心臟病(RHD)的標志物。Delunardo等[22]發現鏈球菌-Vim交叉反應性抗體誘發RHD。鏈球菌產生的HSP70和SRRP1蛋白與心臟內皮細胞Vim的α螺旋結構域有兩個相同的結構域，交叉反應性抗體攻擊內皮細胞Vim從而造成損傷，激活IRAK1(白細胞介素1受體相關激酶)和NF-κB，使促炎因子和GF(生長因子)表達及釋放。

前期體內實驗研究發現慢性移植腎病(CAN)受體Vim反應性T細胞和抗Vim抗體的數量急劇升高[23]。Rose[24]研究發現，B細胞缺陷的小鼠同種異體心臟移植后，過繼轉移含AVA(Vim自身抗體)的血清即引起超急性排斥反應，提示Vim自身抗體能強化免疫損害。

3.2細胞因子特性與固有免疫Gharbi等[25]發現PGA1(抗炎制劑)能夠靶向修飾Vim的第328位的半胱氨酸殘基，使Vim蛋白功能發生缺失，從而發揮抗炎作用。

Bargagna-Mohan等[26]首次發現Vim在GFS(青光眼濾過手術)纖維化模型中的藥理作用。可溶性Vim可上調E3泛素連接酶skp2的表達，抑制p27kip1蛋白酶降解，促進p27kip1的降解。而p27kip1具有抑制細胞增殖，保護組織和細胞免受炎癥損傷的作用。從而證實Vim可依賴Skp2- p27kip1通路產生促炎效應，并促進纖維化發生。而WFA對Vim有濃度依賴性的特異性抑制作用，能阻止GFS術后的纖維化。

前期的體外實驗也發現Vim劑量依賴性地刺激淋巴細胞增殖，且對預致敏或未致敏淋巴細胞的增殖效應無顯著差異，提示Vim具有非特異性免疫活化功能。

Mor-Vaknin 等[27]證實激活的人巨噬細胞能分泌波形蛋白到細胞外。這種分泌受促炎信號通道調節，TNF-α刺激信號增強，IL-10則反之。Thiagarajan等[28]進一步證實MCP-1(單核細胞趨化蛋白-1)促進單核細胞釋放Vim，提示Vim參與固有免疫應答。

Thiagarajan等[28]觀察到非Toll樣模式識別受體Dectin-1(人樹突狀細胞源性C型凝集素樣受體-1)與分泌型磷酸化Vim的直接結合，提示Vim為Dectin-1的內源性配體。并進一步證實炎癥動脈壁的MDM(單核來源的巨噬細胞)分泌磷酸化Vim到胞外，刺激Dectin-1并激活MDM的Nox產生大量的NADPH O2-，使募集到胞內的LDL(低密度脂蛋白)氧化，最終形成動脈粥樣硬化特征性的泡沫細胞和脂質沉積。

4結語

綜上所述，Vim作為Ⅲ型IFs蛋白，有復雜的功能特征。在細胞內Vim參與了細胞分化、黏附、移行、信號傳導和凋亡等功能。而在細胞外，RA、RHD、CAN及動脈粥樣硬化等慢性炎癥疾病的研究發現 Vim與自身免疫、固有免疫有較多的聯系。對于Vim在免疫反應、炎癥及慢性纖維化的交互過程中發揮的作用及具體機制有待闡明和揭示。對Vim的研究會為此類疾病的治療提供新的理論基礎。

參考文獻：

[1]Parry DA.Hendecad repeat in segment 2A and linker L2 of intermediate filament chains implies the possibility of a right-handed coiled-coil structure[J].J Struct Biol,2006,155(2):370-374.

[2]Hess JF,Budamagunta MS,Voss JC,etal.Structural characterization of human vimentin rod 1 and the sequencing of assembly steps in intermediate filament formation in vitro using site-directed spin labeling and electron paramagnetic resonance[J].J Biol Chem,2004,279(43):44841-48446.

[3]Alberts B,Johnson A,Lewis J,etal.Molecular Biology of the Cell[M].4th ed.New York:Garland Science,2002:891-946.

[4]Lahat G,Zhu QS,Huang KL,etal.Vimentin is a novel anti-cancer therapeutic target;insights from in vitro and In vivo mice xenograft studies[J].PLoS One,2010,5(4):e10105.

[5]Rodriguez MI,Peralta-Leal A,O Valle F,etal.PARP-1 regulates metastatic melanoma through modulation of vimentin-induced malignant transformation[J].PLoS Genet,2013,9(6):e1003531.

[6]Nie minen M,Henttinen T,Merinen M,etal.Vimentin function in lymphocyte adhesion and transcellular migration[J].Nat Cell Biol,2006,8(2):156-162.

[7]Burgstaller G,Gregor M,Winter L,etal.Keeping the vimentin network under control:cell-matrix adhesion-associated plectin 1f affects cell shape and polarity of fibroblasts[J].Mol Biol Cell,2010,21(19):3362-3375.

[8]Ivaska J,Vuoriluoto K,Huovinen T,etal.PKCepsilon-mediated phosphorylation of vimentin controls integrin recycling and motility[J].EMBO J,2005,4(22):3834-3845.

[9]Kim H,Nakamura F,Lee W,etal.Fila min A is required for vimentin-mediated cell adhesion and spreading[J].Am J Physiol Cell Physiol,2010,298(2):221-236.

[10]Menko AS,Bleaken BM,Libowitz AA,etal.A central role for vimentin in regulating repair function during healing of the lens epithelium[J].Mol Biol Cell,2014,25(6):776-790.

[11]丁隆,楊宇,何淑玲,等.miR-22在肝細胞癌中的表達及其與上皮鈣黏蛋白、波形蛋白的相關性[J].世界華人消化雜志,2014,22(21):3142-3147.

[12]Stevens C,Henderson P,Nimmo ER,etal.The intermediate filament protein,vimentin,is a regulator of NOD2 activity[J].Gut,2013,62(5):695-707.

[13]Tolstonog GV,Belichenko-Weitzmann IV,Lu JP,etal.Spontaneously immortalized mouse embryo fibroblasts:growth behavior of wild-type and vimentin-deficient cells in relation to mitochondrial structure and activity[J].DNA Cell Biol,2005,24(11):680-709.

[14]Mor-Vaknin N,Legendre M,Yu Y,etal.Murine colitis is mediated by vimentin[J].Sci Rep,2013,3(1045):1-8.

[15]Ise H,Goto M,Komura K,Akaike T,etal.Engulfment and clearance of apoptotic cells based on a GlcNAc-binding lectin-like property of surface vimentin[J].Glycobiology,2012,22(6):788-805.

[16]馬曉春,孔寧,高繼明,等.豬波形蛋白對PRRSV感染Marc-145細胞的抑制作用[J].山東農業科學,2012,44(10):1-6.

[17]Garg A,Barnes PF,Porgador A,etal.Vimentin expressed on Mycobacterium tuberculosis-infected human monocytes is involved in binding to the NKp46 receptor[J].J Immunol,2006,177(9):6192-6198.

[18]Chi F,Jong TD,Wang L,etal.Vimentin-mediated signalling is required for IbeA+E.coli K1 invasion of human brain microvascular endothelial cells[J].Biochem J, 2010,427(1):79-90.

[19]Kanlaya R,Pattanakitsakul SN,Sinchaikul S,etal.Vimentin interacts with heterogeneous nuclear ribonucleoproteins and dengue nonstructural protein 1 and is important for viral replication and release[J].Mol Biosyst, 2010,6(5):795-806.

[20]宗明,張慧,孫立山,等.瓜氨酸化波形蛋白對樹突狀細胞成熟及功能的影響[J].現代免疫學,2012,32(2):135-139.

[21]Carrier N,Cossette P,Daniel C,etal.The DERAA HLA-DR alleles in patients with early polyarthritis:protection against severe disease and lack of association with rheumatoid arthritis autoantibodies[J].Arthritis Rheum,2009,60(3):698-707.

[22]Delunardo F,Scalzi V,Capozzi A,etal.Streptococcal-vimentin cross-reactive antibodies induce microvascular cardiac endothelial proinflammatory phenotype in rheumatic heart disease[J].Clin Exp Immunol,2013,173(3):419-429.

[23]方成,李琦,劉立,等.慢性排斥腎移植大鼠繼發對自身組織蛋白vimentin的細胞和體液免疫反應[J].中國免疫學雜志,2012,28(1):45-48.

[24]Rose ML.Role of anti-vimentin antibodies in allograft rejection[J].Hum Immunol,2013,74(11):1459-1462.

[25]Gharbi S,Garzon B,Gayarre J,etal.Study of protein targets for covalent modification by the antitumoral and anti-inflammatory prostaglandin PGA1:focus on vimentin[J].J Mass Spectrom,2007,42(11):1474-1484.

[26]Bargagna-Mohan P,Deokule SP,Thompson K,etal.Withaferin A effectively targets soluble vimentin in the glaucoma filtration surgical model of fibrosis[J].PLoS One,2013,8(5):e63881.

[27]Mor-Vaknin N,Punturieri A,Sitwala K,etal.Vimentin is secreted by activated macrophages[J].Nat Cell Biol,2003,5(1):59-63.

[28]Thiagarajan PS,Yakubenko VP,Elsori DH,etal.Vimentin is an endogenous ligand for the pattern recognition receptor Dectin-1[J].Cardiovasc Res,2013,99(3):494-504.

[收稿2015-04-20修回2015-06-01]

(編輯倪鵬)

中圖分類號R392.32

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0436-04

作者簡介：陳卓(1990年-)，女，主要從事免疫藥理學研究，E-mail:chenzhuoc@sina.com。通訊作者及指導教師：方成(1972年-)，男，副教授，碩士生導師，主要從事免疫生物學和免疫藥理學研究，E-mail:fang_cheng@foxmail.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.032

①本文受湖北省教育廳科研計劃項目(Q20121808)、國家自然科學基金項目(31370867)資助。