沙棘多糖對急性肝損傷小鼠氧化應激的抑制作用及其對BCL-2/Bax和PPAR-γ的調控①

劉　芳　趙世敏　張　威　謝基明　鄒　凱　張曉慧　王　雪　劉　歡　陳俊娜　王玉珍

(內蒙古農業大學生命科學學院，呼和浩特010018)

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·生物治療·

沙棘多糖對急性肝損傷小鼠氧化應激的抑制作用及其對BCL-2/Bax和PPAR-γ的調控①

劉芳趙世敏張威謝基明②鄒凱張曉慧王雪劉歡陳俊娜王玉珍

(內蒙古農業大學生命科學學院，呼和浩特010018)

[摘要]目的：以LPS/D-GalN誘導的小鼠急性肝損傷作為模型，研究沙棘多糖對急性肝損傷的保護作用及其對BCL-2/Bax和PPAR-γ的調控。方法：C57BL/6系雄性小鼠隨機分為六組：正常組(CTRL)；模型組(L/G)；地塞米松陽性對照組(DXM)；沙棘多糖低(SPL)、中(SPM)、高劑量組(SPH)。SPL、SPM和SPH組分別用50、100、200 mg/kg沙棘多糖溶液連續灌胃14 d，然后采用D-GalN(700 mg/kg)聯合LPS(10 μg/kg)腹腔注射誘導急性肝損傷。建模4 h后采集血清和并收集肝臟組織，檢測ALT、AST的活性和丙二醛(MDA)的含量。通過Western blot檢測肝臟組織中SOD2及BCL-2和Bax的表達水平。通過免疫組織化學法測定肝臟PPAR-γ的表達。結果：ALT、AST水平在模型組顯著升高(P<0.01)，沙棘多糖預處理后劑量依賴地降低了ALT和AST水平(P<0.01)；模型組的MDA比正常組顯著升高(P<0.01)，沙棘多糖各劑量組比模型組都有顯著降低(P<0.01)。模型組的SOD比正常組顯著降低(P<0.01)，沙棘多糖各劑量組比模型組都有顯著升高(P<0.01)；沙棘多糖預處理后降低了Bax的表達水平，對BCL-2的表達沒有明顯的影響。沙棘多糖各劑量組中PPAR-γ的表達量與模型組相比明顯降低。結論：沙棘多糖對LPS/D-GalN誘導的氧化應激有抑制作用，其作用與上調SOD2的表達以及抑制Bax的表達有關。

[關鍵詞]沙棘多糖；肝損傷；BCL-2；Bax；PPAR-γ

肝病在我國的發病率處于較高水平，保肝和護肝也成為大眾關注的重點。氧化應激參與了多種肝臟疾病的發生和發展過程。LPS/D-GalN誘導的急性肝損傷可使肝臟組織MDA含量升高，SOD活性降低，發生氧化應激反應[1]。當細胞受到氧化應激等刺激時,可以通過死亡配體或線粒體途徑激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白9 (Caspases 9)，兩種方式都導致Caspase 3的激活，促進細胞凋亡發生[2]。

細胞發生凋亡時，線粒體膜的通透性受到BCL-2蛋白家族的調控。BCL-2是目前公認的抗凋亡基因，而其同族另一成員Bax則誘導凋亡，當Bax同源二聚體形成時則促使細胞凋亡，當BCL-2與Bax形成異源二聚體時則抑制凋亡，因此BCL-2/Bax的比例在一定程度上調節凋亡的發生。所以，細胞凋亡發生與否和BCL-2家族蛋白的調控密切相關。許多研究表明，BCL-2蛋白在體外和體內都能夠保護細胞并發揮抗凋亡作用[3,4]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ (Peroxisome proliferators activated receptor gamma，PPAR-γ)屬于細胞核受體家族，研究證實PPAR-γ激活后可以抑制細胞增殖[5,6]。但這些研究主要針對腫瘤，肝臟損傷時PPAR-γ與氧化應激的關系的研究較少。近年來，許多文獻報道了植物多糖對急慢性肝臟損傷疾病有保護作用[7,8]。研究發現，沙棘果實、葉、根和種子等各部器官中含有豐富的營養及藥用成分[9,10]。本實驗研究沙棘多糖對肝臟氧化應激的抑制作用及其對BCL-2/Bax和PPAR-γ的調控，為進一步闡明肝損傷機制及其預防提供實驗依據，對沙棘多糖可能作用的信號途徑進行研究探索，為預防肝病的發生和新藥物的開發奠定基礎。

1材料與方法

1.1實驗材料與試劑8周齡雄性C57BL/6小鼠60只購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，標準化喂養；沙棘多糖(SP)來自內蒙古農業大學生命科學學院分子免疫學實驗室；LPS、D-GalN(G0500)購自Sigma公司；地塞米松磷酸鹽注射液(國藥H41020055)購自鄭州卓峰制藥有限公司；MDA和SOD測試盒均購自南京建成生物工程研究所有限公司；PPAR-γ抗體購自美國Cell Signaling公司；免疫組化二抗和DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Western blot二抗購自LI-COR公司。

1.2方法

1.2.1動物實驗方法C57BL/6系雄性小鼠隨機分為六組，每組10只：(A)正常組 (CTRL)；(B)LPS/D-GalN誘導的肝損傷模型組(L/G)；(C)地塞米松組 (DXM)；(D)沙棘多糖低劑量組(SPL)；(E)沙棘多糖中劑量組(SPM)；(F)沙棘多糖高劑量組(SPH)。沙棘多糖低、中、高劑量組分別用50、100、200 mg/kg沙棘多糖溶液連續灌胃14 d。D-GalN(700 mg/kg)聯合LPS (10 μg/kg) 腹腔注射誘導小鼠急性肝損傷模型。

1.2.2血清中ALT、AST的檢測通過全自動生化分析儀測定血清中ALT、AST的含量，測定結果由內蒙古人民醫院檢驗科提供。

1.2.3肝臟中MDA含量的檢測將得到的小鼠肝臟組織勻漿按照MDA測定試劑盒的步驟來操作，檢測肝臟組織中MDA的活性。檢測原理為：過氧化脂質降解產物中的MDA可以與硫代巴比妥酸產生縮合反應，產物為紅色物質，該物質在532nm處有特征吸收峰，通過紫外可見分光光度計檢測吸光值，可推知MDA的含量。

1.2.4Western blot檢測肝臟組織按照重量∶體積=1∶9的比例加入組織蛋白抽提液，經破碎后4 000 r/min離心10 min即得到10%肝臟勻漿，利用BCA試劑盒方法檢測蛋白含量。經SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕法轉膜到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)。5% BSA封閉1 h后，PVDF膜加入SOD2、Bax、BCL-2一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜后加入二抗室溫孵育1 h，再次洗膜后用Odyssey紅外激光掃描成像儀檢測蛋白表達量，并分析其變化。

1.2.5免疫組織化學染色石蠟切片經常規脫蠟水化后采用免疫組化法(IHC) 檢測PPAR-γ的表達，嚴格按照SP試劑盒操作說明進行。

2結果

2.1沙棘多糖對血清中ALT、AST活性的影響血清中的ALT、AST通常被當作急性肝損傷早期的重要生化指標。從表1可以看出，4 h模型組均比正常對照組的ALT、AST活性有顯著升高(P<0.01)，表明在注射LPS/D-GalN后，動物模型建造成功。沙棘多糖顯著抑制了小鼠血清中ALT和AST活性的上升，且各劑量組與模型組對比均具有統計學意義(P<0.01)，并且具有劑量依賴性。

2.2沙棘多糖對肝臟中MDA含量的影響MDA是檢測機體內脂質過氧化程度的重要指標，可以間接地反映出細胞損傷的程度。表2結果顯示，模型組的MDA比正常組顯著升高(P<0.01)，沙棘多糖各劑量組比模型組都有顯著降低(P<0.01)。由此表明沙棘多糖顯著抑制了肝損傷小鼠肝臟MDA含量的升高。

2.3沙棘多糖對肝臟中SOD-2含量的影響SOD是清除炎癥過程中產生的過氧化物游離基的最重要酶之一。從圖1中看出，肝臟中模型組的SOD都比正常組顯著降低(P<0.01)，沙棘多糖各劑量組的SOD活性比模型組有顯著升高(P<0.05，P<0.01)，其中高劑量組的效果要優于中、低劑量組。由此表明沙棘多糖對肝損傷小鼠肝臟中SOD的降低具有抑制的作用。

2.4沙棘多糖對肝臟中Bax和BCL-2含量的影響可以由Western blot檢測結果看出 (圖2、3)，模型組與對照組相比，Bax和BCL-2表達均增高。沙棘多糖組和模型組相比，Bax表達量顯著降低，BCL-2沒有明顯變化；沙棘多糖低、中、 高劑量組中BCL-2和Bax的表達量比值依次升高。結果表明沙棘多糖通過促進BCl-2/Bax的比例，增加抗凋亡能力。

GroupsALT(U/L)AST(U/L)CRTL42.36±0.271)165.00±9.001) L/G91.80±6.95330.90±28.72DXM60.06±3.401)243.46±12.251)SPL66.12±6.43252.90±13.151)SPM57.72±2.341)254.50±11.151)SPH46.20±1.901)232.28±10.291)

Note：Compared with L/G group.1)P<0.01.

GroupsMDA(U/mgprot)CTRL1.07±0.131)L/G2.57±0.28DXM1.18±0.171)SPL1.72±0.161)SPM1.71±0.131)SPH1.27±0.161)

Note：Compared with L/G group,1)P<0.01.

圖1　Western blot檢測沙棘多糖對肝臟中SOD2的影響Fig.1　Effects of seabuckthorn polysaccharide on express-ion of hepatic SOD2 Note: A.CTRL；B.L/G；C.DXM；D.SPL；E.SPM；F.SPH.

圖2　Western blot檢測沙棘多糖對肝臟中Bax的影響Fig.2　Effects of seabuckthorn polysaccharide on hepatic expression of BaxNote: A.CTRL；B.L/G；C.DXM；D.SPL；E.SPM；F.SPH.

圖3　Western blot檢測沙棘多糖對肝臟中BCL-2的影響Fig.3　Effects of seabuckthorn polysaccharide on express-ion of hepatic BCL-2Note: A.CTRL；B.L/G；C.DXM；D.SPL；E.SPM；F.SPH.

圖4　免疫組化檢測沙棘多糖對肝臟中PPAR-γ的影響(×200)Fig.4　Effects of seabuckthorn polysaccharide on express-ion of PPAR-γ in liver by immunohistochemistry(×200)Note: A.CTRL；B.L/G；C.DXM；D.SPL；E.SPM；F.SPH.

2.5沙棘多糖對PPAR-γ表達的影響通過實驗結果可以看出(見圖4)，正常組的小鼠肝臟中PPAR-γ有一定量的本底表達，基本集中在胞漿中。模型組中PPAR-γ的表達則明顯升高，在胞漿中出現大量的PPAR-γ，但只有少量進入到細胞核。地塞米松組中PPAR-γ大量進入到細胞核中，胞漿中明顯減少。沙棘多糖各劑量組中PPAR-γ的表達量與模型組相比明顯降低。

3討論

本實驗通過LPS/D-GalN共同作用誘導急性肝損傷的發生。LPS可以引起體內天然免疫系統的激活，產生大量前炎癥因子，這些炎性因子可引起一系列的炎癥反應，D-GalN的作用是消耗肝細胞內的磷酸尿嘧啶核苷酸使細胞處于異常狀態，成倍放大LPS的效應。地塞米松是一種糖皮質激素，可以抑制多種炎癥細胞因子的生成，抑制脂質過氧化的產生，穩定細胞膜和溶酶體膜。當LPS/D-GalN共同作用還會引起強烈的炎癥反應，從而引起肝細胞彌漫性變性、壞死、炎癥細胞的浸潤等。結合ALT和AST的檢測結果，充分表明沙棘多糖可以明顯抑制LPS/D-GalN誘導小鼠急性肝損傷，進而發揮抗炎的作用。LPS/D-GalN共同誘導能促使聚集在受損肝細胞周圍的中性粒細胞產生呼吸暴發和脫顆粒，釋放氧自由基和導致脂質過氧化。SOD是體內清除氧自由基的重要的酶，被認為是保護細胞免受過氧化損傷的關鍵，但大量氧自由基會打破體內的動態平衡，使SOD表達量下降。MDA是脂質過氧化的產物，被認為是重要的過氧化指標。其他研究顯示很多植物多糖都可以通過抗氧化的能力來使SOD活性上升和MDA含量下降。通過本研究發現沙棘多糖也可以明顯促進SOD的活性和降低MDA的量，這表明沙棘多糖通過抑制LPS/D-GalN誘導的肝細胞過氧化損傷，從而達到抗氧化的作用。為了研究沙棘多糖對急性肝損傷小鼠氧化應激的抑制作用機制，本實驗對Bax，BCL-2進行了檢測。研究提示,BCL-2蛋白家族在細胞凋亡過程中起重要作用，Bax基因是BCL-2基因家庭的成員之一,Bax基因受到重視是因為它與BCL- 2基因在細胞凋亡的調控中起著中心作用。本實驗結果表明沙棘多糖抑制了Bax的表達，但是對BCL-2的影響不大，我們推測沙棘多糖可能通過抑制Bax的表達以及促進別的抗凋亡蛋白的表達來發揮對LPS/D-GalN誘導的急性肝損傷的保護作用。本實驗進一步對轉錄因子PPAR-γ的表達進行了檢測。PPAR-γ可以在多個水平調控細胞內多條炎癥信號轉導途徑。實驗結果顯示PPAR-γ的表達在LPS/D-GalN誘導的急性肝損傷模型組中顯著增高，提示可能為一種應激性反應，因為有研究表明PPAR-γ活化后能抑制肝臟氧化應激反應[11]。沙棘多糖作用后，PPAR-γ的表達降低，提示沙棘多糖可能不是通過調控PPAR-γ來發揮抑制肝臟氧化應激反應的。

根據以上論述，沙棘多糖提取物顯著降低了LPS/D-GalN誘導的小鼠血清中ALT和AST水平；抑制了MDA的產生；促進了肝臟SOD活性升高。其機制可能與抑制Bax的表達有關，轉錄因子PPAR-γ可能不參與沙棘多糖的調控作用。

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[收稿2015-07-25修回2015-10-10]

(編輯張曉舟)

Inhibitory effects of seabuckthorn polysaccharide on oxidative stress in mice with actue liver injury and modulatory effect on BCL-2/Bax and PPAR-γ expression

LIUFang,ZHAOShi-Min,ZHANGWei,XIEJi-Ming，ZOUKai,ZHANGXiao-Hui,WANGXue,LIUHuan,CHENJun-Na,WANGYu-Zhen.

CollegeofLifeSciences,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Huhhot010018,China

[Abstract]Objective:To explore the inhibitory effects of seabuckthorn polysaccharide on hepatic oxidative stress in a mice model of acute liver injury induced by intraperitoneal injection of LPS and D-GalN and detect the expression on hepatic BCL-2/Bax and PPAR-γ.Methods: C57BL/6 male mice were randomly divided into six groups:control group(CTRL),model group (L/G),dexamethasone positive control group(DXM),low (SPL),medium (SPM) and high dose group (SPH) of seabuckthorn polysaccharide.Mice in the SPL,SPM and SPH group were gavaged with 50,100 and 200 mg/kg seabuckthorn polysaccharide for 14 days respectively.Acute liver injury model were established by intraperitoneal injection of LPS(10 μg/kg) and D-GalN (700 mg/kg).Serum and liver samples were collected 4 h after model establishment.Serum levels of ALT and AST and the content of MDA were detected.Hepatic expression of SOD2 BCL-2 and Bax was determined by Western blot and the expression of PPAR-γ was detected by immunohistochemistry.Results: ALT and AST levels significantly increased in the model group and decreased dose-dependently after pretreatment with seabuckthorn polysaccharide.The level of MDA in the model group increased significantly as compared with the control group and decreased in seabuckthorn polysaccharide groups,while the level of SOD2 decreased in the model group and recovered in seabuckthorn polysaccharide groups.The expression of Bax decreased after pretreatment with seabuckthorn polysaccharide.There was no obvious effect on BCL-2 expression after sea buckthorn polysaccharide supplementation.The expression of PPAR-γ reduced in the seabuckthorn polysaccharide group as compared with the model group.Conclusion: Seabuckthorn polysaccharide protects against LPS/D-GalN-induced liver injury.The effect is associated with an upregulation of SOD2 and downregulation of Bax.

[Key words]Seabuckthorn polysaccharide；Liver injury ；BCL-2；Bax；PPAR-γ

中圖分類號R392.5

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0358-04

通訊作者及指導教師：王玉珍(1976年-)，女，教授，主要從事感染與免疫方面的研究。

作者簡介：劉芳 (1992年-)，女，在讀碩士，主要從事分子免疫學的研究。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.014

①本文為國家自然科學基金(No.31270922, 81260662，81560677，81360394)和內蒙古自然科學基金(2015MS0884)資助項目。

②內蒙古自治區人民醫院檢驗科，呼和浩特010020。