六味地黃丸對自發性2型糖尿病模型小鼠胰島素表達水平的影響①

呂　璐　鄭源強　張精彩　李斯琦　王曉東　尹　星　徐　佳　韓新榮　石艷春

(內蒙古醫科大學自治區分子生物學重點實驗室，呼和浩特010058)

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六味地黃丸對自發性2型糖尿病模型小鼠胰島素表達水平的影響①

呂璐鄭源強張精彩②李斯琦②王曉東②尹星②徐佳②韓新榮②石艷春

(內蒙古醫科大學自治區分子生物學重點實驗室，呼和浩特010058)

[摘要]目的：探討不同劑量六味地黃丸對自發性2型糖尿病模型小鼠血清和胰島內胰島素表達水平的影響。方法：將6～8周齡自發性2型糖尿病模型小鼠(KK-Ay小鼠)隨機分3組(無藥對照組、低劑量組、高劑量組)，C57BL/6J小鼠作為遺傳對照組，各組小鼠分別給予蒸餾水或六味地黃丸灌胃15周。每周測定空腹血糖、體質量、攝食量；給藥15周后，ELISA法測定小鼠外周血血清胰島素含量，免疫熒光法和免疫組織化學法檢測胰島中胰島素表達水平，比較各組檢測結果。結果：六味地黃丸給藥后，KK-Ay小鼠空腹血糖降低，體質量和攝食量得到控制；給藥組小鼠血清胰島素含量和胰島內胰島素表達水平明顯降低，且低劑量組的降低程度比高劑量組更明顯。結論：六味地黃丸對自發性2型糖尿病模型小鼠高血糖、肥胖、胰島素抵抗具有一定的治療作用，且低劑量組降低血清和胰島內胰島素水平的效果優于高劑量組。

[關鍵詞]六味地黃丸；自發性2型糖尿病；動物模型；胰島素抵抗；胰島素

六味地黃丸初記于《小兒藥證直訣》，由熟地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓六味藥組成，主治腎陰虛。近年研究表明，六味地黃丸具有免疫調節、抗腫瘤、抗氧化、降血壓、降血糖、抗脂質過氧化損傷等功效[1，2]。糖尿病已經成為威脅人類健康的非傳染性疾病之一，國際糖尿病聯盟統計數據顯示：2011年全球糖尿病人數已達到3.7億，其中大多分布于發展中國家[3]，預計2035年全球將有近5.31億糖尿病患者[4]。目前認為2型糖尿病是一種天然免疫和慢性亞臨床炎癥疾病，該病及其并發癥的發生與機體低度炎癥密切相關。炎癥會影響胰島B細胞功能，當炎癥發生時全身組織會產生胰島素抵抗現象[5-8]。臨床實踐中，六味地黃丸常用于糖尿病及其并發癥的輔助治療。本研究旨在探討不同劑量六味地黃丸對自發性2型糖尿病模型小鼠的治療作用尤其是對血清胰島素含量和胰島組織中胰島素表達水平的影響，為更好地了解六味地黃丸對糖尿病及其并發癥的治療效果和作用機制提供一定的實驗依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組自發性2型糖尿病模型小鼠(SPF級KK-Ay小鼠，雌性)24只，6～8周齡，隨機分為3組，每組8只，即無藥對照組、低劑量組和高劑量組。C57BL/6J小鼠8只，6～8周齡。KK-Ay小鼠和C57BL/6J小鼠的體質量均為18～20 g/只。購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2014-0004。C57BL/6J小鼠作為遺傳對照組，即正常組。高糖飼料：購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2009-0008。

1.1.2主要試劑及儀器濃縮六味地黃丸[北京同仁堂(集團)有限責任公司]，小鼠血清胰島素ELISA試劑盒(RD Systems)，anti-insulin單克隆抗體(BD公司)，FITC標記羊抗兔IgG二抗(Sigma公司)，封閉液(北京康為世紀生物科技有限公司)，DAB試劑盒(武漢博士得生物工程有限公司)。主要儀器：ZEISS Axio observer Z1活細胞工作站，Olympus圖像采集分析系統等。

1.2方法

1.2.1小鼠灌胃給藥并監測平均空腹血糖、體質量及平均攝食量變化各組小鼠購買后先進行2周適應性飼養，并全程給予高糖飼料。第3周開始灌胃給藥，各組每只小鼠灌胃0.1 ml/次，2次/日。六味地黃丸用無菌蒸餾水配成混懸液，低劑量組和高劑量組的給藥濃度分別為70和140 mg/ml(按照濃縮六味地黃丸藥品說明書并根據開始灌胃時全部小鼠平均體重為37.51 g，綜合換算給藥量。140 mg/ml是按正常成人給藥劑量換算而得，70 mg/ml為減半給藥劑量)；無藥組和遺傳對照組給予同劑量無菌蒸餾水。每周一晚23∶00撤除飼料，次日早上7∶00測空腹血糖、體質量，計算平均攝食量。

1.2.2小鼠血清胰島素含量檢測灌胃給藥15周后，每組隨機抽取2只小鼠摘眼球取非抗凝外周血，37℃靜置30 min析出血清后，1 500 r/min離心5 min，收集血清后-20℃保存。ELISA法檢測小鼠血清胰島素含量，操作步驟根據試劑盒說明書進行，每個樣本設2個復孔。

1.2.3免疫熒光法和免疫組織化學法觀察小鼠胰腺組織學變化(1)免疫熒光法:胰腺組織蠟塊切片成4 μm厚度的石蠟帶，用防脫載玻片撈片，烤片、脫蠟、水化后，經抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶活性、封閉液封閉后，滴加一抗(即胰島素抗體)，4℃過夜，二抗(即FITC標記羊抗兔IgG二抗)室溫孵育1 h，用DAPI對細胞核染色3 min，水溶性封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。(2)免疫組織化學法:按照常規方法及DAB試劑盒說明書操作。

2結果

2.1各組小鼠平均空腹血糖、體質量及平均攝食量變化

2.1.1平均血糖值變化高劑量組小鼠的平均血糖在第1～3周直線升高，在第3周后下降，之后在遺傳對照組(血糖正常組)平均血糖波動區間波動。低劑量組小鼠的血糖在第1～3周也升高，增長斜率低于高劑量組，給藥后2周仍有小幅度升高，隨后下降，于給藥4周后降到遺傳對照組(血糖正常組)平均血糖波動區間并相對平穩波動。無藥對照組小鼠的血糖在第1～3周升高(與高劑量組小鼠平均血糖值相近)后仍維持高水平狀態，之后以高于低劑量組和高劑量組小鼠的平均血糖值的狀態波動。統計學分析組間比較采用單因素方差分析：F=2.81，P=0.046<0.05，差異有統計學意義；采用LSD檢驗結果表明：高劑量、低劑量組、遺傳對照組小鼠的平均血糖水平與無藥對照組均有差異(P值分別為0.011、0.030、0.034，均<0.05)，高劑量組與低劑量組小鼠平均血糖值之間的差異不具有統計學意義(P=0.699>0.05)。結果如圖1所示，說明六味地黃丸可以降低糖尿病模型小鼠的血糖水平。

2.1.2平均體質量變化遺傳對照組小鼠平均體質量變化呈平直線，其余各組小鼠均在第1～3周升高，之后維持在高水平狀態，且高劑量組和無藥對照組小鼠的平均體質量變化相近，以高于低劑量組小鼠平均體質量的水平變化。統計學分析組間比較采用單因素方差分析：F=283.78，P=0.000<0.01，差異有統計學意義且差異顯著；采用LSD檢驗結果表明：低劑量組小鼠的平均體質量變化與高劑量組和無藥對照組均具有顯著差異(P值均為0.000，均<0.01)。結果如圖2所示，提示低劑量給藥方案對小鼠體質量的控制效果優于高劑量組。

2.1.3平均攝食量變化無藥對照組和遺傳對照組小鼠的平均攝食量波動范圍較大；高劑量組小鼠在給藥5周前波動較大，之后在略高于低劑量組的水平以小幅度波動；低劑量組在給藥后波動范圍小。

低劑量組小鼠的平均攝食量低于無藥對照組和高劑量組，且差異有統計學意義(采用兩個獨立樣本的秩和檢驗，Z值分別為-2.073和-2.972，P分別為0.038和0.003)；高劑量組和無藥對照的平均攝食量差異不具有統計學意義(采用兩個獨立樣本的秩和檢驗，Z=-1.060，P=0.289)。結果如圖3所示，說明低劑量給藥方案對小鼠攝食量的控制效果優于高劑量組。

圖1　各組小鼠飼養18周平均血糖含量比較Fig.1　Concentrations of fast blood glucose in different groups of mice in 18 weeks

2.2血清胰島素含量的變化各組小鼠胰島素ELISA檢測結果顯示：無藥對照組明顯高于其余各組，呈高胰島素血癥樣；低劑量組和高劑量組均高于遺傳對照組，且低劑量組胰島素水平低于高劑量組，結果如圖4所示，表明六味地黃丸可以降低自發性2型糖尿病小鼠的血清胰島素水平。

圖2　各組小鼠飼養18周平均體質量變化Fig.2　Average body weight in different groups of mice in 18 weeks

圖3　各組小鼠飼養18周平均攝食量比較Fig.3　Average food consumptions in different groups of mice in 18 weeks

圖4　各組小鼠血清胰島素含量Fig.4　Insulin concentrations in sera from different groups of miceNote: **.P<0.01; *.P<0.05.1.No drug control;2.Hight-dose；3.Low-dose；4.Genetic control.

圖5　免疫熒光法檢測小鼠胰腺組織胰島素表達水平(×100)Fig.5　Immunofluorescence results of pancreases from different groups' mice(×100)Note: A. No drug control group; B. High-dose group; C. Low-dose group; D. Genetic control group; E.PBS control.

圖6　免疫組織化學法檢測小鼠胰腺組織胰島素表達水平(×100)Fig.6　Immunohistochemistry results of pancreases from different groups′ mice(×100)Note: A. No drug control group; B.High-dose group; C.Low-dose group; D.Genetic control group; E.PBS control.

2.3胰島組織中胰島素表達水平檢測結果由免疫熒光法和免疫組織化學法檢測結果可以看出，無藥對照組小鼠胰島中胰島素水平很高，明顯高于其余各組；低劑量組小鼠胰島中胰島素表達水平低于高劑量組，見圖5、6。

3討論

糖尿病(DM)尤其是2型糖尿病已成為威脅我國人民生命健康的最重要非傳染性疾病之一，但確切的發病機制尚待進一步深入研究，糖尿病的遷延不愈及長期用藥導致的機體病變成為目前比較棘手的問題。六味地黃丸是中醫治療該病的代表方劑之一，臨床上廣泛用于糖尿病及其并發癥的輔助治療。KK-Ay小鼠作為典型的自發性2型糖尿病模型小鼠，于1957年由日本學者通過植入黃色肥胖基因(Ay基因)到KK/Ta鼠后培育而成，該小鼠通常被認為是一種多基因疾病模型，其自發表現出高血糖、糖耐量異常、高胰島素血癥、輕度肥胖癥，與人的發病特征相似[9]。本研究所用雌性KK-Ay鼠均于10～12周齡左右出現體質量增加、血糖升高，出現典型的2型糖尿病癥狀，而遺傳對照組C57BL/6J小鼠未出現。實驗結果表明：無藥對照組小鼠的血糖明顯高于其余各組，說明六味地黃丸具有降血糖的功效，高、低劑量組對血糖的影響差異不具有統計學意義。治療組小鼠血清胰島素和胰島內胰島素含量顯著降低，且六味地黃丸延緩了小鼠血糖升高程度及高血糖的出現。上述結果提示，六味地黃丸有助于控制血糖、降低胰島素表達，可能具有促進胰島素與臟器作用，增加臟器對胰島素的敏感性，從而減輕KK-Ay小鼠高胰島素血癥樣癥狀。杜華等研究結果也提示六味地黃丸能夠改善OLEFT大鼠肝臟胰島素抵抗[10]。此外，通過每周對小鼠體質量和攝食量的觀察結果發現，治療組小鼠的體質量、攝食量均得到較好的控制，且低劑量組效果好于高劑量組。

本實驗探討了六味地黃丸對KK-Ay小鼠的治療作用尤其是對血清胰島素含量和胰島組織中胰島素表達水平的影響，并對藥物劑量進行了比較研究，實驗結果證實了六味地黃丸對KK-Ay小鼠具有明顯的治療作用，同時發現低劑量組的綜合治療效果達到甚至優于高劑量組。中醫講究辯證施治，針對糖尿病病程、主要臨床癥狀、累及主要臟器及其損傷程度等進行差異化治療。本研究進一步提示六味地黃丸對2型糖尿病的治療作用可能與其具有降低血糖、降低胰島素表達等相關，同時給藥劑量與治療效果之間存在相關性，該實驗結果對指導臨床用藥具有一定的參考價值。

參考文獻：

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[3]中華醫學會糖尿病學分會.中國2型糖尿病防治指南(2013年版)[J].中國糖尿病雜志,2014,6(7):447-498.

[4]Ramachandran A,Snehalatha C,Ma RC.Diabetes in South-East Asia:An update[J].Diabetes Res Clin Pract,2014,103(2):231-237.

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[7]Winer S,Winer DA.The adaptive immune system as a fundamental regulator of adipose tissue inflammation and insulin resistance[J].Immunol Cell Biol,2012,90(8):755-762.

[8]Huang Q,Xue J,Zou R,etal.NR4A1 is associated with chronic low-grade inflammation in patients with type 2 diabetes[J].Exp Ther Med,2014,8(5):1648-1654.

[9]Tomino Y.Lessons from the KK-Ay mouse,a spontaneous animal model for the treatment of human type 2 diabetic nephropathy[J].Nephrourol Mon,2012,4(3):524-529.

[10]杜華,薛耀明,朱波.六味地黃丸改善OLETF鼠肝臟胰島素抵抗的實驗研究[J].南方醫科大學學報,2012,32(12):1824-1827.

[收稿2015-11-06修回2016-02-03]

(編輯許四平)

Effects of Liuweidihuang pill on insulin levels in sera and pancreatic islets from spontaneous mouse models of human type 2 diabetes administrated with different doses

LüLu,ZHENGYuan-Qiang,ZHANGJing-Cai,LISi-Qi,WANGXiao-Dong,YINXing,XUJia,HANXin-Rong,SHIYan-Chun.

InnerMongoliaKeyLaboratoryofMolecularBiology,InnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010058,China

[Abstract]Objective:To investigate the effects of Liuweidihuang pill on the insulin levels in sera and pancreatic islets from spontaneous mouse models of human type 2 diabetes administrated with different doses.Methods: The 6-8 week-old KK-Ay mice were randomly divided into three groups including no drug control group,low-dose group and high-dose group,in addition C57BL/6J mice were used as a genetic control group.All the animals were given with different dose Liuweidihuang pill solutions or sterile distilled water by intragastrical administration for fifteen weeks.The fasting blood glucose,body mass and food consumption were measured weekly.The serum insulin levels were surveyed by ELISA.And the insulin levels in the pancreas islets were detected by immunofluorescence and immunohistochemistry.Results: Decreased fasting blood glucose,controlled body mass and food consumption,and lower levels of insulin in the sera and pancreas islets were confirmed from the KK-Ay mice administered with Liuweidihuang pill.Furthermore,the low dose program exhibits a stronger effect.Conclusion: Liuweidihuang pill has exhibited relatively therapeutic effects in the spontaneous type 2 diabetes mice including controls of hyperglycemia and body mass and relieving insulin resistance.In addition,the low-dose regimen showed even better treatment in controlling insulin levels in the sera and pancreas islets.

[Key words]Liuweidihuang pill;Spontaneous type 2 diabetes;Animal model;Insulin resistance;Insulin

中圖分類號R967

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0350-04

作者簡介：呂璐(1988年-)，女，主要從事抗感染免疫與中藥免疫研究，E-mail: 805614039@qq.com。通訊作者及指導教師：石艷春(1958年-)，女，教授，主要從事抗感染免疫與疫苗研究，E-mail: ycshi5388@163.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.012

·中醫中藥與免疫·

①本文為內蒙古自治區自然科學基金(2012MS1126)，內蒙古醫科大學英才培育項目資助。

②內蒙古醫科大學護理學院，呼和浩特010058。

韓新榮(1957年-)，男，教授，主要從事中醫藥與免疫學研究工作。