柴胡提取物對PMS肝氣郁證模型大鼠額葉5-HT3A/3BR分布與蛋白表達的影響

李　芳，王杰瓊，宋春紅，魏　盛，張惠云，喬明琦

(1．北京市豐臺婦幼保健院藥劑科，北京　100069;2．山東中醫藥大學中醫藥經典理論教育部重點實驗室，山東濟南　250355)

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柴胡提取物對PMS肝氣郁證模型大鼠額葉5-HT3A/3BR分布與蛋白表達的影響

李芳1，王杰瓊2，宋春紅2，魏盛2，張惠云2，喬明琦2

(1．北京市豐臺婦幼保健院藥劑科，北京100069;2．山東中醫藥大學中醫藥經典理論教育部重點實驗室，山東濟南250355)

中國圖書分類號: R-332; R284．1; R256．49; R322．81; R363-332; R392．11; R711．51

關鍵詞:柴胡提取物;經前期綜合征;肝氣郁證;額葉; 5-HT3AR; 5-HT3BR;蛋白表達

喬明琦( 1955－)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向:肝藏象生理病理與情志致病機制，通訊作者，E-mail: qmingqi@163．com

Effects of Bupleurum extract on distribution and expression of 5-HT3A/3BR in frontal cortex of premenstrual syndrome model rats with liver-qi depression

LI Fang1，WANG Jie-qiong2，SONG Chun-hong2，WEI Sheng2，ZHANG Hui-yun2，QIAO Ming-qi2
( 1．Pharmacy Dept，Fengtai Maternal＆Children's Health Hospital of Beijing，Beijing100069，China; 2．Key Laboratory for Classical Theory of Traditional Chinese Medicine of Education Ministry，Shangdong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China)

Key words:Bupleurum extracts; premenstrual syndrome; liverqi depression; frontal cortex; 5-HT3AR; 5-HT3BR; protein expression

經前期綜合征肝氣郁證( premenstrual syndrome，PMS)癥狀表現類似于現代醫學中的抑郁樣情緒改變，前期研究證明PMS肝氣郁證的發生與腦內5-HT系統及其受體密切相關［1］，柴胡提取物通過不同分子機制干預PMS肝氣郁證的抑郁情緒［2－3］。但是柴胡提取物在5-HT3R水平對PMS肝氣郁證經前抑郁情緒的干預機制尚未見報道，因此，本實驗選取PMS肝氣郁證為動物模型初步探討柴胡提取物調控抑郁情緒的微觀作用機制。

1　材料

1．1實驗動物Wistar大鼠，體質量( 180～200) g，♀，由山東中醫藥大學動物中心提供，實驗動物許可證號: SCXK(魯) 2011－0003。

1．2藥品與主要試劑柴胡提取物(青島陽光海川醫藥科技發展有限公司生產，批號: 20110526) ; Anti-5-HT3Areceptor antibody ( ab51950)，Anti-HTR3B( MFG40388)，5-HT3A二抗( Abcam，ab-16248)，5-HT3B二抗( sc-2020)。

2　方法

2．1PMS肝氣郁證大鼠模型制備及取材根據文獻方法選取大鼠(隨機分為3組，每組12只)并復制PMS肝氣郁證模型［3］，連續造模5 d，治療組大鼠造模同時灌胃柴胡提取物( 0. 32 g·kg－1)，正常對照組和模型組各給予相同體積的生理鹽水。將每組6只大鼠用多聚甲醛心臟灌流，取前額葉，石蠟包被，切片，用于免疫熒光實驗。每組另外6只大鼠，于冰塊上剝離額葉，放于－80℃冰箱，Western blot實驗備用。

2．2免疫熒光雙標記法檢測大鼠額葉5-HT3A/3BR分布石蠟切片常規脫蠟，抗原熱修復，封閉，結合一抗( 1∶400)，復溫、洗滌，結合二抗( 1∶500)，洗滌，滴加甘油，封片。置激光共聚焦顯微鏡下觀察5-HT3AR、5-HT3BR在額葉的分布及同位點表達情況。

2．3Western blot方法檢測大鼠額葉5-HT3A/3BR蛋白表達

以50μg額葉總蛋白每泳道上樣，電泳分離，轉膜，封閉。與一抗( anti-5-HT3B1∶400，anti-5-HT3A1∶400)和β-actin ( 1∶1 500)抗體孵育，洗滌，結合各自相應二抗( anti-5-HT3A1∶400，anti-5-HT3B1∶400)孵育，洗滌，用ECL化學發光試劑檢測雜交信號。

2．4統計學方法實驗數據用Graphpad Prism 5．0統計軟件進行單因變量多因素方差分析。

3　結果

3．1各組大鼠額葉5-HT3A/3BR的定位分布各組大鼠額葉5-HT3AR和5-HT3BR陽性細胞共表達呈黃色，細胞核為藍色熒光，額區陽性細胞均有分布，且多分布于細胞膜，細胞形態多為點狀或圓狀。

3．2各組大鼠額葉5-HT3AR蛋白表達與正常組相比，模型組額葉5-HT3AR蛋白表達明顯升高( P＜0. 05) ;與模型組相比，柴胡提取物組5-HT3AR蛋白表達明顯降低( P＜0. 05)。

3．3各組大鼠額葉5-HT3BR蛋白表達與正常組相比，模型組額葉5-HT3BR蛋白表達明顯升高( P＜0. 05) ;與模型組相比，柴胡提取物組5-HT3BR蛋白表達降低( P＜0. 05)。

4　討論

文獻報道5-HT3AR和5-HT3BR為5-HT3R最主要的兩個受體亞型，且5-HT3AR為5-HT3R離子通道的功能性受體［4］，因此，本實驗以大鼠額葉5-HT3A和5-HT3BR作為研究對象。結果發現，PMS肝氣郁證模型組大鼠額葉5-HT3AR和5-HT3BR蛋白表達均明顯升高，柴胡提取物干預后其蛋白表達明顯降低，由此推測PMS肝氣郁證模型抑郁情緒的發生可能與5-HT3AR和5-HT3BR蛋白上調有關，柴胡提取物通過下調額葉5-HT3AR、5-HT3BR蛋白表達發揮其抗抑郁樣情緒的作用。在下一步的工作中需要繼續尋找柴胡發揮其抗抑郁樣作用與5-HT3R信號轉導通道的關系，以期望更進一步探索PMS的發病機制及柴胡提取物干預PMS肝氣郁證經前抑郁情緒的藥理作用機制。

(致謝:本文實驗在山東中醫藥大學中醫藥經典理論教育部重點實驗室完成，在此深表感謝! )

參考文獻:

［1］李芳，香秋梅，宋春紅，等．經前期綜合征相關性5-羥色胺系統的研究進展［J］．醫學綜述，2014，20( 22) : 4048－50．

［1］Li F，Xiang Q M，Song C H，et al．The study of premenstrual syndromes associated 5-serotonin system［J］．Med Recapitul，2014，20 ( 22) : 4048－50．

［2］宋春紅，李芳，郭英慧，等．舒郁膠囊及主要組份對PMS肝氣郁證大鼠海馬中CACNA1C蛋白表達和功能的影響［J］．中國藥理學通報，2014，30( 10) : 1476－7．

［2］Song C H，Li F，Guo Y H，et al．Effects of Shuyu capsule and its main composition on protein expression and function of CACNA1C in hippocampus of rat with PMS liver-qi stagnation［J］．Chin Pharmacol Bull，2014，30( 10) : 1476－7．

［3］Gao X X，Sun P，Qiao M Q，et al．Shu-Yu capsule，a Traditional Chinese Medicine formulation，attenuates premenstrual syndrome depression induced by chronic stress constraint［J］．Mol Med Rep，2014，10( 6) : 2942－8．

［4］Lummis S C．5-HT3receptors［J］．J Biol Chem，2012，287( 48) : 40239－45．

作者簡介:李芳( 1980－)，女，博士，主管中藥師，研究方向:中藥調肝方藥藥理學，Tel: 010-83917191，E-mail: lifanghappy163@163．com;

基金項目:國家自然科學基金資助課題( No 81173163，81173151)

收稿日期:2015－09－01，修回日期: 2015－11－12

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0146－02

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．031