肝細胞癌患者循環腫瘤細胞檢測陽性率與射頻消融治療后短期療效的相關性

馬 超 何 華 董亞冰 趙玲玲 趙恒軍 王楠婭

(吉林大學第一醫院腫瘤中心，吉林 長春 130021)

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肝細胞癌患者循環腫瘤細胞檢測陽性率與射頻消融治療后短期療效的相關性

馬 超 何 華 董亞冰 趙玲玲 趙恒軍 王楠婭

(吉林大學第一醫院腫瘤中心，吉林 長春 130021)

目的 探討肝細胞癌(HCC)患者循環腫瘤細胞(CTC)的檢出率與其他血清腫瘤標志物及射頻消融治療后短期療效的相關性。方法 選擇37例HCC并進行射頻消融治療的患者，術前均進行CTC檢測，并搜集患者臨床特征、血清甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白異質體(AFP-L3)的水平。術后1、3個月分別進行肝臟增強CT/MRI的檢查，依據mRECIST標準評價患者的短期療效，并應用Fisher精確檢驗法統計術前外周血CTC的檢出率及其與AFP、AFP-L3腫瘤標志物水平、射頻消融治療后短期療效的關系。結果 術前CTC陽性患者為8例(21.6%)。其中巴塞羅那(BCLC)分期為0～A期20例，CTC檢測陽性者7例(35%)，BCLC分期為B～C期17例，CTC檢測陽性者1例(5.9%)，不同BCLC分期患者CTC陽性率有統計學差異(P=0.048)。經過射頻消融治療后，21例在1個月和3個月時進行療效評價達完全緩解(CR)，16例為部分緩解(PR)或在3個月內疾病進展。3個月內復查達到CR的21例有3例(14.3%)CTC檢測陽性。療后達PR或3個月內進展的16例中5例(31.3%)CTC陽性。兩組無統計學差異(P=0.254)。8例CTC陽性的患者中有1例AFP>400 ng/ml、5例AFP-L3>1；CTC陰性的29例患者中有8例表現為AFP>400 ng/ml、4例表現為AFP-L3>1，兩組AFP水平無統計學差異(P=0.649)、AFP-L3水平有明顯差異(P=0.012)。結論 初診為中晚期HCC患者的CTC檢測陽性率無顯著提高，隨AFP-L3水平升高CTC陽性率增高，但對于AFP而言該趨勢不明顯。

肝細胞癌；循環腫瘤細胞；射頻消融

循環腫瘤細胞(CTC)是指存在于外周血中的各類腫瘤細胞的統稱，因自發或診療操作從實體腫瘤病灶脫落而進入外周血液中，大部分CTC在進入外周血后發生凋亡或被吞噬，少數能夠逃逸并錨著于相應的器官最終發展成為轉移灶，從而增加惡性腫瘤患者的死亡風險〔1〕。CTC的檢測可以用于預測某些實體腫瘤的預后及指導治療。但是，肝細胞癌(HCC)患者血清CTC的檢出率、CTC的水平與治療或預后的關系仍不明確。本研究將以此為研究重點，為尋找對HCC有預測、預后價值的生物標志物提供理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2012年9月至2013年3月期間在我院腫瘤內科經影像學及病理活檢確診為HCC患者37例，男31例，女6例。年齡36～77(中位53)歲。HCC病理學診斷依照 WHO 腫瘤分類及診斷標準，分期根據巴塞羅那(BCLC)分期標準進行0期2例，A期18例，B期10例，C期7例。甲胎蛋白(AFP)≥400 ng/ml 9例；甲胎蛋白異質體(AFP-L3)>1 28例；伴發病毒性乙型肝炎者31例；伴發病毒性丙型肝炎者6例。

1.2 外周血標本的預處理 CellSearch系統由CellTracks AutoPrep、CellTracks AnalyzerⅡ分析儀以及CellSave儲存管、試劑盒組成。CellSave專用收集管采集患者外周血液，標記批量處理中每個患者樣本的15 ml錐形管，倒置5次，混合批次中所有CellSave儲存管，從每個CellSave儲存管向相應標記的錐形管中倒入7.5 ml血液，向每個錐形管中加入6.5 ml稀釋緩沖液，蓋緊含有血液和稀釋液的錐形管，并倒置5次進行混勻，離心10 min，樣本制備好后1 h內在CellTracks AutoPrep系統上處理。采血后于室溫儲存并于96 h內進行檢測。

1.3 CTC檢測操作步驟 CellSearch試劑盒包括上皮細胞黏附分子抗體(EpCAM)包被的免疫磁珠、細胞角蛋白(CK)及白細胞分化抗原45(CD45)的熒光抗體、細胞固定劑和緩沖液。標本經預處理后在CellTracks AutoPrep系統上進一步采用含有免疫磁珠的試劑進行孵育，通過納米磁珠捕獲靶細胞(即EpCAM陽性細胞)，細胞固定后分別加入藻紅蛋白標記的CK8/18/19抗體，藻藍蛋白標記的CD45抗體，而后應用熒光染料標記結合的靶細胞。此后，經上述處理的樣本注入樣本盒中，在MagNest裝置中，捕獲的細胞遷移至分析表面，在此由CellTracks AnalyzerⅡ分析儀的成像軟件進行計算分析。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗。

2 結 果

2.1 治療前CTC檢測結果 8例(21.6%)治療前CTC檢測結果為陽性，其中，BCLC分期為0～A期20例中CTC檢測陽性者7例(35%)；B～C期17例中CTC檢測陽性者1例(5.9%)，不同BCLC分期的HCC患者CTC陽性率差異顯著(P=0.048)。

2.2 治療后短期內療效與治療前CTC檢測結果分析 經射頻消融治療后依據mRECIST標準對患者的病情進行評估，有21例病情達到完全緩解(CR)，其中3例(14.3%)表現為治療CTC陽性。16例治療后病情表現為部分緩解(PR)或3個月內進展，其中5例(31.3%)為治療前CTC檢測陽性。兩組陽性率差異無統計學意義(P=0.254)。

2.3 CTC檢測結果與AFP、AFP-L3的相關性 在CTC陽性的8例患者中，有1例(12.5%)AFP>400 ng/ml、5例(62.5%)AFP-L3>1，CTC陰性的29例中8例(27.6%)的AFP>400 ng/ml、4例(13.8%)AFP-L3>1，兩組AFP水平差異無統計學意義(P=0.649)、AFP-L3水平有明顯差異(P=0.012)。

3 討 論

對于腫瘤，早期診斷和治療是提高生存率的關鍵〔2，3〕。就HCC而言，常規的影像學檢查并不能發現微小浸潤性病變，亦不能對疾病做出準確評判〔4〕。

郭柏棠〔5〕應用CanPatrolTMCTCs技術對296例HCC患者進行CTC檢測，結果顯示陽性率達71.43%，而且治療前CTC陽性患者無瘤生存期較CTC陰性患者明顯縮短，患者CTC水平與BCLC分期呈正相關。Kornelius等〔6〕應用CellSearch系統檢測了59例HCC患者CTC水平，30.5%的患者檢測到了CTC的存在，進一步分析提示CTC陽性率與BCLC分期相關，即分期越晚陽性率越高，而且CTC陽性患者往往伴隨AFP水平的升高。Sun等〔7〕在一項研究中納入123例HCC患者，治療前CTC檢測陽性率為66.67%，研究以每7.5 ml血液中2個CTC為臨界值，結果顯示手術前CTC≥2個/7.5 ml血樣可作為疾病復發的預后指標。

本研究部分結果與上述結果有偏差，如BCLC分期為0～A期的患者CTC檢測陽性率較B～C期患者高，且CTC 陽性與AFP水平無明顯相關性，可能系樣本量過少產生偏倚所致，但是綜合分析上述幾組研究結果可以看出CTC檢測對于HCC有一定預后意義，高的CTC檢出率與高的CTC水平往往伴隨不良的生存結局。CTC作為新的生物學標志物值得進一步深入研究，但當今關于HCC患者CTC的相關研究以單中心、小樣本居多，應當積極進行多中心、大樣本、前瞻性分析盡力探索CTC在HCC中的應用價值〔8〕。AFP是目前HCC診斷及監測復發最常用的指標，但對于那些低AFP水平甚至AFP陰性的患者，CTC對于疾病復發的預測則更具優勢〔9〕，而且AFP也并非預測HCC細胞播散的敏感指標，例如在本研究中，部分患者CTC呈陽性，但是AFP卻處于正常水平；應加快研究CTC在HCC療效評價中的作用，通過在臨床治療前進行CTC檢測建立基數水平，在治療過程中監測 CTC數目的變化從而明確治療效果及疾病進展情況，從而使臨床醫生能更好地為患者制訂個性化治療方案，盡量避免醫療資源的浪費〔10〕；另外，在精準醫療逐漸到來的時代，可以通過CTC從分子生物學角度更好地反映疾病特征，或許在此過程中可以找尋到新的治療靶點，最終應用于臨床造福患者〔11〕。

1 滕 飛，傅志仁.肝細胞肝癌循環腫瘤細胞研究進展及其在肝移植中的應用前景〔J〕.中華移植雜志，2013；7(3)：29-33.

2 Forner A，Llovet IM，Bruix J.Hepatocellular carcinoma〔J〕.Lancet，2012；379：1245-55.

3 Sherman M.Hepatocellular carcinoma：epidemiology，risk factors，and screening〔J〕.Semin Liver Dis，2005；25(2)：143-54.

4 Rodriguez-Peralvarez M，Luong TV，Andreana L，etal.A systematic review of microvascular invasion in hepatocellular carcinoma：diagnostic and prognostic variability〔J〕.Ann Surg Oncol，2013;20(1)：325-39.

5 郭柏棠.肝細胞癌患者循環腫瘤細胞檢測與預后關系的初步研究〔D〕.廣州：南方醫科大學，2015：1-60.

6 Kornelius Schulze，Christin Gasch，Katharina Staufer，etal.Presence of EpCAM-positive circulating tumor cells as biomarker for systemic disease strongly correlates to survival in patients with hepatocellular carcinoma〔J〕.Int J Cancer，2013；133(9)：2165-71.

7 Sun YF，Xu Y，Yang XR，etal.Circulating stem cell-like epithelial cell adhesion molecule-positive tumor cells indicate poor prognosis of hepatocellular carcinoma after curative resection〔J〕.Hepatology，2013；57(4)：1458-68.

8 龍建云，李 靜，黃 亮，等.肝癌循環腫瘤細胞臨床應用研究進展〔J〕.肝膽胰外科雜志，2016；28(1)：79-83.

9 Wong KF，Xu Z，Chen J，etal.Circulating markers for prognosis of hepatocellular carcinoma〔J〕.Exp Opin Med Diagn，2013；7(4)：319-29.

10 Liu MC，Shields PG，Warren RD，etal.Circulating tumor cells：a useful predictor of treatment efficacy in metastatic breast cancer〔J〕.J Clin Oncol，2009;27：5153-9.

11 Kelley RK，Magbanua MJM，Butler TM，etal.Circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma：a pilot study of detection，enumeration，and next-generation sequencing in cases and controls〔J〕.BMC Cancer,2015;15：206.

〔2015-12-31修回〕

(編輯 曹夢園)

國家自然科學基金青年基金資助項目(81201673)；吉林省教育廳課題資助(440030031191)；吉林大學優秀青年教師培育計劃(419080500365)；吉林大學白求恩培育計劃(470110000488)

王楠婭(1980-)，女，副教授，主要從事肝癌研究。

馬 超(1989-)，男，碩士，主要從事惡性腫瘤研究。

R73

A

1005-9202(2016)20-5047-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.050