基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜在臨床微生物檢驗(yàn)的應(yīng)用進(jìn)展

李　欣　高海軍　張　勤　許建成

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林　長(zhǎng)春　130021)

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基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜在臨床微生物檢驗(yàn)的應(yīng)用進(jìn)展

李欣高海軍1張勤許建成

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林長(zhǎng)春130021)

〔關(guān)鍵詞〕基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜；微生物；鑒定

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)是一種新型的質(zhì)譜技術(shù)，具有靈敏度高，樣品用量少，分析速度快的特點(diǎn)。目前，MALDI-TOF已開(kāi)始應(yīng)用于多項(xiàng)微生物的檢測(cè)，為臨床疾病的診療提供有效的指導(dǎo)。

1MALDI-TOF鑒定微生物的特點(diǎn)及優(yōu)勢(shì)

MALDI-TOF系統(tǒng)由基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源(MALDI)、飛行時(shí)間質(zhì)量分析器(TOF)和檢測(cè)器組成，屬于一種軟電離技術(shù)，適用于混合物及生物大分子的測(cè)定〔1〕。其原理是利用激光照射待測(cè)物與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，通過(guò)基質(zhì)吸收能量并將能量轉(zhuǎn)移至待測(cè)物分子，使分子解離成離子，利用離子在電場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)的性質(zhì)，按離子質(zhì)菏比(m/z)的大小順序進(jìn)行收集和記錄，得到質(zhì)譜圖,與數(shù)據(jù)庫(kù)中各種已知微生物的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對(duì)，從而完成對(duì)微生物的鑒定。

而直至目前，臨床實(shí)驗(yàn)室仍然非常依賴傳統(tǒng)的微生物鑒定方法，耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低，遠(yuǎn)不能滿足臨床感染性疾病病原體快速診斷的需要。在此基礎(chǔ)上，16S rRNA測(cè)序、PCR因其快速，精確的優(yōu)勢(shì)，對(duì)微生物的鑒定起到重要作用，但其操作復(fù)雜，價(jià)格昂貴〔2,3〕,仍不能滿足一般臨床微生物鑒定的需求。MALDI-TOF這種技術(shù)樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，無(wú)需對(duì)樣品預(yù)評(píng)估，樣本的預(yù)處理僅需3步(挑選菌落、點(diǎn)樣、加入基質(zhì))，3 min內(nèi)即可完成全部的預(yù)處理，所需耗材如乙醇、乙腈、甲酸等為常用試劑，成本低廉。其鑒定結(jié)果采用得分形式，具有清晰、準(zhǔn)確性〔4〕,國(guó)內(nèi)有研究顯示鑒定準(zhǔn)確率可達(dá)到95%以上〔5〕,另有國(guó)外學(xué)者Nomura〔6〕高度評(píng)價(jià)其為微生物領(lǐng)域具有革命性的轉(zhuǎn)折。

2MALDI-TOF在微生物領(lǐng)域鑒定的應(yīng)用

2.1細(xì)菌最新研究顯示，MALDI-TOF在細(xì)菌的鑒定中取得了顯著的成效，研究通過(guò)將MALDI-TOF與傳統(tǒng)全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏分析系統(tǒng) (VITEK 2)比較，不符合的標(biāo)本再與“金標(biāo)準(zhǔn)”16s rRNA測(cè)序方法比較，發(fā)現(xiàn)臨床常見(jiàn)細(xì)菌如葡萄球菌(99.7%)〔5〕、腸桿菌(96.7%)〔7〕、非發(fā)酵革蘭陰性桿菌(98.75%)〔8〕等的鑒定準(zhǔn)確率令人可觀。

2.1.1革蘭陰性菌2013年Richter等〔7〕研究顯示該技術(shù)對(duì)于絕大多數(shù)腸桿菌可鑒定到種水平，但大腸埃希菌和志賀菌仍不能嚴(yán)格區(qū)分，需要附加試驗(yàn)加以佐證。MALDI-TOF可準(zhǔn)確鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌〔9〕。對(duì)于變形桿菌只能鑒定到屬水平，無(wú)法區(qū)分普通變形桿菌與奇異變形桿菌〔5〕。依據(jù)目前的數(shù)據(jù)庫(kù)，弧菌屬(97%)〔10〕、加德納菌屬(97.4%)〔11〕、枸櫞酸桿菌屬〔7〕、伯克霍爾德菌(100%)〔12〕等鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，已經(jīng)被用于臨床感染性疾病病原體的鑒定。

2.1.2革蘭陽(yáng)性菌目前已有多項(xiàng)研究表明葡萄球菌、腸球菌菌種水平的鑒定準(zhǔn)確率近乎100%〔5,7〕，但是，該技術(shù)在鏈球菌的鑒別存在缺陷，對(duì)肺炎鏈球菌與緩癥鏈球菌尚難以區(qū)分，需要進(jìn)一步試驗(yàn)鑒定。其他陽(yáng)性菌如棒狀桿菌屬〔13〕、李斯特菌〔14〕、乳酸球菌〔15〕等的鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.1.3厭氧菌近年來(lái)，厭氧菌的鑒定在內(nèi)源性感染性疾病中受到了廣泛的關(guān)注。隨著MALDI-TOF進(jìn)入微生物實(shí)驗(yàn)室在厭氧菌鑒定研究的不斷深入，2014年在一項(xiàng)對(duì)106份厭氧菌的研究中，MALIDI-TOF與傳統(tǒng)技術(shù)的鑒定結(jié)果一致率可達(dá)95.3%〔16〕，另有大量關(guān)于其在厭氧菌鑒定方面的應(yīng)用〔17～19〕,旨在通過(guò)低分子量的蛋白質(zhì)譜，對(duì)消化鏈球菌屬、普雷沃菌屬、脆弱類桿菌、丙酸桿菌屬、乳桿菌屬、破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌屬的鑒定及臨床感染性疾病的診治提供更有價(jià)值的信息。

2.1.4分枝桿菌MALDI-TOF在鑒定分枝桿菌時(shí)，需通過(guò)特殊的蛋白提取步驟，更為有效的蛋白萃取方法，進(jìn)而建立分枝桿菌蛋白標(biāo)記物的數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)大多數(shù)分枝桿菌的鑒定起到關(guān)鍵作用。2015年Tudo等〔20〕研究顯示，在結(jié)核桿菌方面，該技術(shù)仍不能鑒定到菌種水平，除一些親緣關(guān)系密切的菌種，如鳥(niǎo)分枝桿菌與胞內(nèi)分枝桿菌，偶發(fā)分枝桿菌與膿腫分枝桿菌、龜分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌之間難以鑒別，大多數(shù)分枝桿菌都能用MALDI-TOF技術(shù)鑒別。

2.2真菌在真菌鑒定方面，MALDI-TOF不僅優(yōu)于傳統(tǒng)生化鑒定程序，而且可以區(qū)分親緣關(guān)系密切的菌屬〔21〕，如白色念珠菌與都柏林念珠菌、近平滑念珠菌(1型、2型、3型)、光滑念珠菌與布拉加念珠菌等。已建立的龐大數(shù)據(jù)庫(kù)為MALDI-TOF絲狀真菌的鑒定提供了基礎(chǔ)，Becker等〔22〕研究顯示MALDI-TOF在絲狀真菌菌種水平鑒定的精確率達(dá)95.4%。此外，De Respinis等〔23〕拓展了皮膚絲狀真菌的數(shù)據(jù)庫(kù)，其中包含13種菌屬與131種菌，在8種菌屬鑒定的準(zhǔn)確率可達(dá)到100%。

2.3病毒在感染性疾病中，病毒因其嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生，分離培養(yǎng)較困難，需時(shí)很長(zhǎng)，且有些病毒至今仍不能培養(yǎng)，需采取快速診斷的方法得以鑒定，而MALDI-TOF憑借其高通量、周期短的優(yōu)勢(shì)逐漸在臨床病毒學(xué)領(lǐng)域扮演重要角色。Calderaro等〔24〕通過(guò)檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎病毒特異蛋白(VP)從而鑒定感染細(xì)胞和非感染細(xì)胞,并且聯(lián)合應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)純化蛋白質(zhì)以提高對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒檢測(cè)的敏感性和特異性，節(jié)省了核酸分析的時(shí)間，為疾病的治療爭(zhēng)分奪秒。此外MALDI-TOF在病毒檢測(cè)方面不僅與傳統(tǒng)技術(shù)具有較高的一致性〔25〕，同時(shí)在大規(guī)模流行病學(xué)研究方面具有較大的潛能〔25〕。

2.4耐藥菌株除鑒定正常的微生物菌群外，MALDI-TOF也被用于耐藥菌株的鑒定。Du等〔26〕早期研究發(fā)現(xiàn)MALDI-TOF可以將耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)與甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)區(qū)分開(kāi)來(lái)。Luo等〔5〕、Kempf等〔27〕研究證實(shí)MALDI-TOF在檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶尤其是內(nèi)酰胺酶方面具有特異度高、準(zhǔn)確度高的優(yōu)勢(shì)。Li等〔28〕通過(guò)檢測(cè)頭孢噻肟與69株G-菌孵育后水解產(chǎn)物的量，表明MALDI-TOF在檢測(cè)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的G-菌中具有潛在的臨床價(jià)值，今后可在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室廣泛開(kāi)展。2014年Lange 等〔29〕通過(guò)采用MALDI-TOF成功鑒定耐美羅培南的肺炎克雷伯桿菌，準(zhǔn)確度達(dá)97.3%，特異度達(dá)93.5%。然而，因腸球菌(如糞腸球菌和屎腸球菌)，腸桿菌(如大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌)這些菌株所得的耐藥菌株與正常菌株的質(zhì)譜圖沒(méi)有明顯差異，所以該技術(shù)尚不能對(duì)該菌株耐藥性做出準(zhǔn)確的鑒定。

3MALDI-TOF的局限性

首先，MALDI-TOF數(shù)據(jù)庫(kù)仍需不斷完善，對(duì)于一些稀有菌種和親緣關(guān)系緊密的菌株(大腸埃希菌與志賀菌)的鑒定容易造成誤差〔7〕。同時(shí)，MALDI-TOF目前尚不能為某個(gè)特定菌種設(shè)定一個(gè)具體分離該菌的閾值；當(dāng)樣品含多個(gè)菌種時(shí)，MALDI-TOF只能區(qū)分到亞種水平，且當(dāng)某一菌種數(shù)量占據(jù)絕對(duì)主導(dǎo)地位時(shí)，MALDI-TOF分離和鑒定會(huì)受到明顯限制。再者，MALDI-TOF鑒定血培養(yǎng)陽(yáng)性菌屬時(shí)，血液中的血紅蛋白、白蛋白會(huì)干擾質(zhì)譜信息，因此必須提前對(duì)樣本進(jìn)行額外的凈化處理〔18〕。另外，MALDI-TOF雖然可以成功鑒定產(chǎn)碳青霉烯酶耐藥菌株，但對(duì)于其他細(xì)菌及真菌耐藥機(jī)制的研究尚不明確。此外，靶板點(diǎn)樣，涂布均一性，菌株本身生長(zhǎng)速度，這些因素都會(huì)影響檢測(cè)的敏感性、可靠性，值得我們進(jìn)一步研究。從理論上講，MALDI-TOF可以直接鑒定血液、尿液、腦脊液等體液中的病原微生物，但實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)這些體液中可能含有非蛋白物質(zhì)，會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)譜信息產(chǎn)生一定的干擾。因此，通過(guò)優(yōu)化樣本提取或萃取步驟，MALDI-TOF有望成為更為高效的微生物鑒定方法。

4展望

MALDI-TOF是一項(xiàng)快速、簡(jiǎn)潔、準(zhǔn)確鑒定病原微生物的新型技術(shù)，如能將MALDI-TOF用于鑒定微生物毒素蛋白，我們就可以借此了解微生物的致病因素，對(duì)于新型爆發(fā)菌株的致病性研究具有很大的意義。隨著質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)及操作規(guī)程不斷完善和規(guī)范化，MALDI-TOF的方法必將成為臨床微生物鑒定的重要工具，為臨床感染性疾病的診治提供巨大幫助。

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〔2015-12-20修回〕

(編輯李相軍)

通訊作者：許建成(1976-)，男，副教授，副主任醫(yī)師，主要從事細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究。

〔中圖分類號(hào)〕R37

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)13-3336-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.118

1吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)腫瘤外科

第一作者：李欣(1990-)，女，碩士在讀，主要從事臨床微生物學(xué)研究。